摘要：作者研究了芬苯达唑在鲫血浆中的提取和检测方法。通过液-液萃取等步骤对样品进行前处理，用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定芬苯达唑的含量。作者用本方法建立的药物标准曲线相关性较好，相关系数（r）在0.9990以上。本方法准确度高，精密度好， 日内变异系数均小于10%，日间变异系数均小于15%。芬苯达唑在鲫血浆中的检测限为0.02μg/mL，定量限为0.025μg/mL。
关键词：芬苯达唑；鲫；HPLC
1 立题背景与意义
作为水产养殖大国，我国的水产养殖总量已位居全球第一，但随着高密度、集约化水产养殖业的迅猛发展，各种鱼类的寄生虫病也日趋严重，已经很大程度的影响了我国渔业的发展（祝艳蕾，2008）。
芬苯达唑（fenbendazole，FBZ） 作为苯并咪唑类药物的代表之一，自1987年由中国预防医学科学院寄生虫病研究所于国内首次合成，随后经过动物实验便投入了使用。由于其疗效显著，使用安全，芬苯达唑已经越来越受到人们的青睐。国内外关于该药物在鱼体内的研究，尤其是考察两种不同水温条件下芬苯达唑及其代谢物在鱼体内的药物动力学和残留特征尚未见报道。
综合以上，本试验探索了芬苯达唑在鲫血浆中的提取和检测方法，为考察其在鲫体内的药物动力学和残留特征提供依据，为水产养殖中的临床用药提供有效的理论依据。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 试验动物
采用10尾体重为250±30g的健康鲫，喂不添加抗虫药物的鲫全价配合饲料，采用循环水适应性养殖一周，使用增氧机充氧气用以维持水中含氧量，用于采集空白血浆样品。
2.1.2 药品与试剂
芬苯达唑原料药：批号60308045，含量99.5%，购于武汉回盛生物科技有限公司；甲酸、冰乙酸、乙腈为色谱纯，三氯甲烷、甲醇、氨水等均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
2.1.3 仪器设备
2.2 定量方法
2.2.1 所需试液的配制
芬苯达唑标准储备液：精密称取芬苯达唑原料药20.1mg置于 100mL棕色容量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为200μg/mL的标准贮备液，避光置于4℃冰箱中保存备用（有效期2个月）。
血浆标准工作液：用乙腈将标准储备液倍数稀释成下列浓度：20、4、2、1、0.2、0.1μg/mL。
2.2.2 色谱条件
色谱柱：Agilent SB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），保护柱（4.6mm×12.5mm）
流动相：乙腈，0.5%冰醋酸水进行梯度洗脱。梯度洗脱程序见表1
紫外检测波长：292nm
流 速：1.0mL/min
柱 温：30℃
进样量：30μL
2.2.3 血浆样品的处理
从冰箱中取出血浆样品，室温下自然解冻。准确吸取500μL血浆于15mL离心管中，加入125μL氨溶液（0.1mol/L，pH=10），混匀1分钟，再加入3mL乙酸乙酯作为萃取剂，水平振荡2min，然后以5000r/min离心10min，取上层有机相于另一离心管，再加入2mL乙酸乙酯重复萃取，在70℃水浴中通氮气吹干。向萃取残渣中准确加125μL乙腈使之溶解，以5000r/min离心5min，取上清液进样分析。
2.2.4 血浆标准工作曲线
向6支15mL具塞离心管中各加入500μL空白血浆，然后依次加入2.2.1中的血浆标准工作液125μL，便得到药物浓度依次为5、1、0.5、0.25、0.05、0.025μg/ mL的血浆样品。按照血浆样品处理方法处理后，进样分析。以药物的峰面积（A）为横坐标，药物在样品中的浓度（C）为纵坐标，建立标准曲线，求出回归方程以及相关系数（r）。
2.2.5 方法学验证
取空白血浆，添加适量标准储备液，配制成含药物浓度分别为5、1、0.05μg/mL 的血浆样品，按照2.2.3中血浆的处理方法处理并进行HPLC检测，每个浓度设置5个样品以测定日内变异系数，连续重复5d以测定日间变异系数。
3 结果
3.1 芬苯达唑的色谱行为
在本试验建立的色谱检测方法下，图谱中的药物峰形对称性良好，虽有少量杂质峰出现，但芬苯达唑能与杂峰达到较好的分离。
3.2 标准曲线及线性范围
本试验所建立的血浆的标准工作曲线相关性较好，相关系数（r）在0.9990以上，芬苯达唑的回归方程和相关系数为C = 0.0045A - 0.1406，芬苯达唑在空白血浆中的标准工作曲线为y=0.0045x-0.1406，r=0.9997。
3.3 回收率和精密度考察数据
参照2.2.4中所描述的方法，芬苯达唑在血浆中的萃取回收率为：85.02%-90.62%，日内变异系数均小于10%，日间变异系数均小于15%。本试验所建立的方法准确度高，且具有较好的精密度。
3.4 灵敏度考察数据
芬苯达唑在鲫血浆中检测限为0.02μg/mL，定量限为0.025μg/ mL。
4 讨论
本试验选用的检测波长是292nm。这与冯克清（2004），林海丹等（2005）在试验中所选用的280nm有所不同。本试验中，在比较了两个波长后发现，芬苯哒唑在292nm处有最大吸收，药物峰面积大，所建立的方法灵敏度高。经过试验比较，在使用梯度洗脱的过程中，温度的控制非常关键。试验中选用了用恒温箱控制柱温在30℃（Fietouris D J et al.， 1994），在此条件下，方法重现性好，峰形稳定性高。
5 结论
建立了芬苯达唑在鲫血浆中的提取和检测方法
处理血浆样品时，以氨溶液和乙酸乙酯为萃取剂，方法具有良好的准确度和精密度。萃取回收率均在80%以上；日内变异系数小于10%，日间变异系数小于15%。以乙腈和0.5%冰醋酸水作为流动相进行梯度洗脱，Agilent SB-C18色谱柱，292nm紫外检测波长测定药物浓度，峰形对称性良好，无干扰峰影响。
参考文献：
[1] 冯克清.高效液相色谱法测定芬苯达唑原料中的有关物质.中国兽药杂志，2004，38（11）：19-21
[2]Fietouris D J， Botsoglou N A，Psomas I.Rapid ionpair Liquid chrom atographic method for the determinat ion of fenbendazole in cow’s milk. Analyst， 1994（1l9）：2801-2805
[3] 林海丹，谢守新，吴映璇.固相萃取高效液相色谱法测定乳粉中苯并咪唑类药物残留.分析试验室，2005，24（1）：27-29
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