2-甲氧雌二醇对鼻咽癌干细胞增殖、迁移及放疗抵抗性的影响

材料与方法

1.1 材料与试剂

选取鼻咽癌CNE-2细胞，购于中南大学肿瘤研究所;麦康凯琼脂培养基（型号：PM0800-250g，品牌：北京酷来搏科技有限公司）;离心机（型号：BenchMate C8，品牌：Oxford Lab Products）。

1.2 实验方法

1.2.1 构建鼻咽癌CNE-2干细胞模型  将CNE-2细胞放入琼脂培养基中，并放入细胞保温箱中进行多次传代培养，得到大量CNE-2细胞进行冻存，以备进行实验。

1.2.2 实验分组  采用随机数字表法，将构建的CNE-2干细胞分为三组：①0 μmol/L组，培养液中仅加入8 μL二甲基亚砜（DMSO）;②4 μmol/L组，培养液中加入4 μL DMSO和4 μL 2-ME2（浓度4 μmol/L）;③8 μmol/L组，培养液中加入8 μL 2-ME2（浓度8 μmol/L）。

1.2.3 CCK-8细胞增殖实验  将三组细胞分别进行CCK-8细胞增殖，取冻存的CNE-2干细胞，按照15 000 r/min的离心速度进行离心分离，离心半径10 cm，每两毫升Trizol试剂裂解的样品中加入0.4 mL的氯仿，進行裂解操作，25℃水浴采用CCK-8细胞进行诱导增殖，再次15 000 r/min离心10 min再培养，以检测各组细胞增殖活力情况。

1.2.4 Transwell小室迁移实验  将三组细胞分别进行Transwell迁移侵袭实验，取冻存的CNE-2干细胞，按照20 000 r/min的离心速度进行离心后应用基质胶铺板后制备CNE-2干细胞悬液后检测各组细胞迁移和侵袭情况。

1.2.5 克隆形成实验  分别取三组细胞将细胞核取出后，与体细胞细胞质结合，进行克隆培养实验后，对三组细胞分别进行放疗照射，观察细胞存活性。

1.2.6 Western blot检测  将三组细胞分别进行Western blot检测，将培养好的CNE-2干细胞放在两块干净的玻璃平板之间离心后备用，将配制好的聚丙烯酰胺分离胶液体并脱气，然后放入15%的过硫酸铵钠和四甲基乙二胺，轻轻搅拌混匀。按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，将以上两种材料进行充分混合后将分离好的CNE-2干细胞与混合液一起水浴40 min后进行充分清洗，再将硝酸纤维素膜与CNE-2干细胞进行混合后显色以观察NF-κB p65和HIF-1α蛋白表达情况。

1.3 统计学方法

统计分析采用SPSS 19.0软件，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖活力比较

4 μmol/L组和8 μmol/L组细胞OD值明显低于0 μmol/L组（P < 0.05）;8 μmol/L组细胞OD值明显低于4 μmol/L组（P < 0.05）。见表1。

2.2 各组细胞Transwell小室迁移实验比较

4 μmol/L组和8 μmol/L组穿膜细胞数明显少于0 μmol/L组（P < 0.05）;8 μmol/L组穿膜细胞数明显少于4 μmol/L组（P < 0.05）。见表2、图1。

2.3 各组细胞照射后克隆形成能力比较

4 μmol/L组和8 μmol/L组细胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明显低于0 μmol/L组（P < 0.05）;8 μmol/L组细胞0、8 Gy照射后克隆形成能力明显低于4 μmol/L组（P < 0.05）。见表3、图2。

2.4 各组细胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表达比较

4 μmol/L组和8 μmol/L组细胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表达明显低于0 μmol/L组（P < 0.05）;8 μmol/L组细胞NF-κB p65和HIF-1α蛋白表达明显低于4 μmol/L组（P < 0.05）。见表4、图3。

3 讨论

鼻咽癌的病理病因目前认为与三种因素有关，即遗传因素、病毒因素（主要为EB病毒感染）和环境因素，对于鼻咽癌的治疗临床上方法很多，但治疗效果都不确切，本研究主要从基因表达层面抑制鼻咽癌细胞的增殖转移。

2-ME2基因是一种近年来被发现的抑癌物质，2-ME2在机体内有抑制多种蛋白通路和鼻咽癌发生、发展的作用[4]，2-ME2可视为鼻咽癌的“抑癌基因”。2-ME2通过对CNE-2细胞上皮间充质胚胎转化后在鼻咽癌的疾病进程中起到抑癌基因的作用，2-ME2能通过抑制鼻咽癌基因表达从而抑制鼻咽癌CNE-2干细胞的增值、转移和侵袭[5]。本研究证实，2-ME2基因对鼻咽癌细胞CNE-2干细胞特性具有调控作用，并且证明了2-ME2能够特异性调控鼻咽癌相关基因的表达，从而实现其抑制鼻咽癌干细胞增殖的作用，结果提示，可以将2-ME2作为抑制鼻咽癌治疗药物，疗效确切。

本研究应用2-ME2作用于鼻咽癌CNE-2细胞后，检测细胞的增殖、迁移及侵袭能力。采用CCK-8细胞增殖实验检测各组细胞增殖情况，CCK-8是一种检测鼻咽癌细胞存活和生长的方法，检测原理是CNE-2细胞RNA中的琥珀酸脱氢酶，能使外源性CCK-8细胞氧化还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在CNE-2干细胞中，而死细胞无此功能[6]。当细胞增殖时并不影响蓝紫色结晶甲瓒存在于CNE-2干细胞中的数量，会随着细胞增殖而分裂增多，伴随在细胞质中不断裂解为更小的粒子，当CNE-2干细胞增殖趋向最大化完成时，DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在700 nm波长处测定其吸光度值，可间接反映CNE-2细胞增殖的数量[7]。在细胞数量处于可控的范围内时，CCK-8结晶形成的量与细胞数呈正相关关系[8]。CK-8细胞增殖实验法特点是灵敏度高、经济，对于测量出细胞增殖的数量数据准确可靠。

采用Transwell检测各组CNE-2细胞迁移和侵袭，Transwell检测实验是指将CNE-2细胞放入培养板中，培养板中存在上下两个小室，在本研究中上下两个小室内分别存有CNE-2细胞上下两层的层培养液并以聚碳酸酯膜相隔[9]。应用此膜可将CNE-2细胞在不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜上进行细胞迁移、侵袭的研究[10-11]。

研究中需利用Western blot检测各组细胞2-ME2蛋白表达，该方法是采用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，被检测物是CNE-2细胞转录后的2-ME2基因蛋白[12-13]。经过PCR扩增RNA后，将转录后的2-ME2基因蛋白转移到固相载体如琼脂胶体上，固相载体吸附蛋白质后仍能保持电泳分离的2-ME2表达基因的活性[14]。鼻咽癌CNE-2干细胞诱导HIF-1/NF-κB信号通路由联级放大反应活化丝/苏氨酸蛋白激酶组成，该联级反应可放大鼻咽癌组织电生物信号，控制细胞相关的生命活动，促进鼻咽癌增殖和迁移。该通路主要由两种蛋白组成，分别是NF-κB p65和HIF-1α蛋白。有大量研究[15-17]显示，当细胞过度表达NF-κB p65上游激活因子时，能够激活鼻咽癌干细胞增殖迁移能力，抵御外界进行放疗时对鼻咽癌细胞造成损伤，促进鼻咽癌损伤癌细胞进行修复。HIF-1是鼻咽癌HIF-1/NF-κB信號转导通路中的重要细胞因子，对细胞增殖、分化和凋亡都起着非常重要的调控作用，它能诱导鼻咽癌干细胞加速分化[18]，对放射治疗能做出防御反应[19-20]。

本研究结果显示，2-ME2浓度越高，CNE-2干细胞增殖能力越低，说明2-ME2对鼻咽癌细胞具有明显的杀伤抑制作用。2-ME2浓度越高，CNE-2干细胞迁移效率越低，说明2-ME2对鼻咽癌细胞起到抑制作用，并使细胞运动能力下降。2-ME2浓度越高，CNE-2干细胞克隆程度越低，说明2-ME2对鼻咽癌细胞具有明显杀伤作用，阻止CNE-2干细胞克隆繁殖。2-ME2浓度越高，CNE-2干细胞对NF-κB p65、HIF-1α蛋白表达有明显抑制作用，说明2-ME2能抑制HIF-1/NF-κB信号通路，增加放疗的敏感性。本研究的创新点在于，应用2-ME2有效抑制鼻咽癌细胞信号转导通路，抑制相关蛋白表达，并增加放疗敏感性。

综上所述，2-ME2能抑制鼻咽癌干细胞增殖及迁移能力，同时降低其放疗抵抗性，机制可能与其抑制HIF-1/NF-κB信号通路有关，值得进一步研究。

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（收稿日期：2018-12-19  本文编辑：李亚聪）

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