棉花不同组织DNA的不同提取方法比较

摘要：[目的] 研究棉花不同组织DNA 提取的最佳方法。[方法]以棉花嫩叶、种子、黄化苗作为研究对象，比较CTAB法、SDS法、SDS-CTAB法提取DNA的效果。[结果]若对DNA的量没有要求，棉花嫩叶、种子、黄化苗等组织均应选用SDS-CTAB法提取DNA。若对DNA的量有一定要求，如浓度需大于100 ng/μl，质量大于20 000 ng的情况下，针对不同试验材料推荐使用的提取方法是：棉花嫩叶用CTAB法，棉花种子SDS法，棉花黄化苗CTAB法。[结论] 为快速高通量地检测转基因棉花基因漂移距离和频率提供参考。

关键词：棉花;嫩叶;种子;黄化苗;CTAB;SDS;SDS-CTAB

中图分类号 S562 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2015）02-016-03

The Comparative Research on DNA Extraction from Different Organizations by Different Methods

ZHU Wei-long， YAN Shuo， SHI Ji-zhe， LIU Xiao-xia* et al （Department of Entomolagy， China Agricultural University， Beijing 100193）

Abstract [Objective] The aim was to study the comparative on DNA extraction from different organizations by different methods. [Method]The materials of this research were young leaves， seeds and etiolated seedlings of cotton， the effects among methods of CTAB， SDS， SDS-CTAB were compared. [Result] According to the results， if further experiment does not have high requirement of the quantity of DNA， the method of SDS-CTAB should be applied to extracting DNA from young leaves， seeds and etiolated seedlings of cotton. If further experiment has high requirement of the quantity of D NA （ Concentration should be above 100 ng/μl. Mass should be above 20 000 ng）， the best methods for different materials are that： method of CTAB for young leaves of cotton， method of SDS for seeds of cotton， method of CTAB for etiolated seedlings. [Conclusion] The study provided reference for detection of cotton.

Key words Cotton; Young leaf; Seed; Etiolated seedling; CTAB; SDS; SDS-CTAB

基金项目 转基因生物新品种培育重大专项（2014ZX08011002-006）。

作者简介 朱威龙（1989- ），男，广西柳州人，硕士研究生，研究方向：转基因生物安全评价。*通讯作者。

收稿日期 2014-11-27

棉花是我国最重要的经济作物之一，2013年我国棉花种植面积达到472.06万hm2，产量达到667.8万t[1]，其中转基因棉花种植面积为420万hm2[2]。随着Bt棉的大规模种植，基因漂移问题也成为学术界关注的热点。转基因作物中的外源基因可能会漂移到野生近缘种或杂草中，最终给农业生产和生态环境带来负面影响。转基因作物的大量释放很有可能增加农业生态系统的选择压力，甚至破坏原有物种之间的平衡关系[3-4]。因此，转基因棉花的安全性评价是十分必要的，而对其基因漂移的频率和距离进行检测有赖于对样品DNA的提取。有关棉花的研究多集中于分子辅助育种和基础生物学等方面，而其分子标记和基础生物学研究明显滞后于水稻、玉米、油菜等其他作物，主要原因是其DNA的提取和纯化较其他作物更困难[5-6]。棉花富含棉酚、多糖、单宁、蛋白等次生代谢物质，这些次生代谢物易形成与核酸的复合物，影响所提取DNA的质量[7]。

提取棉花DNA的方法主要有CTAB法[5，8]、SDS法[9-13]、SDS-CTAB法[7]。该试验将棉花黄化苗作为研究对象之一，以期降低蛋白质对DNA提取的影响，并在次生代谢物大量累计之前提取棉花DNA，探究其是否对棉花DNA的提取存在有利的影响。笔者以棉花种子、嫩叶为研究对象，找出棉花不同组织DNA的最佳提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料 转基因抗虫抗除草剂棉花（中国农业科学院棉花研究所提供）的种子、嫩叶、黄化苗，非转基因棉花石远321。

1.2 DNA提取缓冲液及其成分

CTAB提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl， 20 mmol/L EDTA， 2%CTAB（W/V）， 2%PVP40（W/V）， 8%NaCl（W/V）， 2%β-巯基乙醇（W/V）。SDS提取缓冲液：1% SDS， 10 mmol/L EDTA， 8%NaCl（W/V）， 50 mmol/L Tris-HCl， 0.5%山梨醇， 1%PVP40（W/V）， 2%β-巯基乙醇（W/V）。TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA。

其他试剂：氯仿∶异戊醇（24∶1），70%乙醇，无水乙醇，异丙醇，5 mol/L KAc。

1.3 DNA提取方法

将棉花种子种于基质（草炭∶蛭石=3∶1）中，未遮光处理得到棉花嫩苗，遮光处理得到棉花黄化苗。取棉花嫩叶圆片约1 cm2（约33.69 mg），棉种约1/4（约19.29 mg），棉花黄化苗圆片约1 cm2（约25.62 mg）。最后根据测出的DNA浓度计算得率：得率（ng/mg）=浓度（ng/μl） X 200（μl） /质量（mg）。

1.3.1 CTAB法。参照宋国立等[5]的方法并稍加改动，步骤如下：将称量好的试验材料置于2 ml离心管底部，加入小钢珠，敞开管盖放入冷冻干燥仪，冷冻干燥24 h后迅速放入球磨仪中振荡研磨35 s（30Times/s）。然后加入经65 ℃预热的800 μl CTAB提取液，置于振荡器上约30 s，放入65 ℃水浴中40 min，每隔10 min上下颠倒1次。水浴后加入800 μl氯仿∶异戊醇（24∶1），上下轻摇混匀约10 min，10 000 r/min离心10 min。取上清（约600 μl）至1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）重提一次，10 000 r/min离心10 min。重取上清（约500 μl）至新1.5 ml离心管中，加入2倍体积（约1 ml）经-20 ℃预冷无水乙醇，缓慢颠倒离心管15次以上。于-20 ℃冰浴静置30 min以上，然后12 000 r/min离心7 min。小心倾去上清，用70%乙醇洗2次，无水乙醇洗1次，风干30 min至干燥后加入200 μl TE，4 ℃保存。

1.3.2 SDS法。参照郭宝生等[12]、刘峰等[13]、匡猛等[14]的方法并稍加改动，步骤如下：将称量好的试验材料置于2 ml离心管底部，加入小钢珠，敞开管盖放入冷冻干燥仪，冷冻干燥24 h后迅速放入球磨仪中振荡研磨35 s（30 Times/s）。然后加入经65 ℃预热的800 μl SDS提取液，置于振荡器上约30 s，放入65 ℃水浴中40 min，每隔10 min上下颠倒1次。水浴后加入800 μl氯仿∶异戊醇（24∶1），上下轻摇混匀约10 min，10 000 r/min离心10 min。取上清（约600 μl）至1.5 ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）重提一次，10 000 r/min离心10 min。重取上清（约500 μl）至新1.5 ml离心管中，加入2倍体积（约1 ml）经-20 ℃预冷异丙醇，缓慢颠倒离心管15次以上。于-20 ℃冰浴静置30 min以上，然后12 000 r/min离心7 min。小心倾去上清，用70%乙醇洗2～3次，无水乙醇洗1次，风干30 min至干燥后加入200 μl TE，4 ℃保存。

1.3.3 SDS-CTAB。参照孙鑫等[7]的方法并稍加改动，步骤如下：将称量好的试验材料置于2 ml离心管底部，加入小钢珠，敞开管盖放入冷冻干燥仪，冷冻干燥24 h后迅速放入球磨仪中振荡研磨35 s（30 Times/s）。然后加入经65 ℃预热的600 μl SDS提取液，置于振荡器上约30 s，于65 ℃水浴40 min。加入200 μl 5 mol/L KAc混匀，冰浴30 min，4 ℃离心，12 000 r/min，10 min。取上清，加入200 μl CTAB提取液，充分混匀，65 ℃水浴20 min。加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提2次，室温离心10 000 r/min，10 min。取上清，加入-20 ℃预冷的异丙醇1 000 μl，缓慢颠倒离心管15次以上。于-20 ℃冰浴静置30 min以上，然后12 000 r/min离心7 min。小心倾去上清，用70%乙醇洗2～3次，无水乙醇洗1次，风干30 min至干燥后加入200 μl TE，4 ℃保存。

1.4 DNA的质量检测。

1.4.1 紫外分光光度法检测。以TE作为空白对照，利用微量紫外分光光度计（Nanodrop2000， Thermo Scientific）检测所提取棉花DNA的浓度、OD260/280，并根据提取DNA前称量的质量计算得率。其中OD260/280应在1.8～2.2符合要求。

1.4.2 PCR及电泳检测

1.4.2.1 DNA模板稀释。

因PCR使用DNA模板2 μl，同时需要保证PCR反应体系内DNA的含量介于20～50 ng，该试验用TE对DNA样本统一稀释至30 ng/μl，置于-20 ℃保存待用。

1.4.2.2 DNA样品的PCR扩增和电泳检测。

由于所选棉花材料都是转基因抗虫抗除草剂棉花品种，故选用特异性引物对样品内CryⅠA（c）基因进行PCR定性检测。上下游引物分别为5′GAAGGATTGAGCAATCTCTAC 3′和5′CAATCAGCCTAGTAAGGTCGT 3′[4]。 PCR反应体系：2×Taq PCR Master Mix 10 μl（北京强欣博瑞生物技术有限公司），上下游引物（10 μ/mol）各0.5 μl（上海生工生物技术有限公司），DNA模板2 μl，ddH2O 7 μl。

反应程序：预变性95 ℃4 min，变性94 ℃ 1 min、退火56 ℃ 1 min、延伸72 ℃ 1.5 min，30个循环，循环结束后总延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。扩增基因CryⅠA（c）的目的片段约为340 bp，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测[15]。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度的比较

对于棉花嫩叶而言，获得DNA浓度最高的方法是CTAB法，SDS法平均浓度达到197 ng/μl以上;对于棉花种子而言，获得DNA浓度最高的方法是SDS法，CTAB法平均浓度达到294 ng/μl以上;对于棉花黄化苗而言，获得DNA浓度最高的方法是SDS法，CTAB法平均浓度达到205 ng/μl以上。这3种材料提取DNA浓度最低的都是SDS-CTAB法，其平均值都低于101 ng/μl（表1）。

对于3种材料的浓度最高值而言：棉花种子（SDS法）>棉花黄化苗（SDS法）>棉花嫩叶（CTAB法）。

对所有试验材料所有方法而言，浓度排在前3位的方法是棉花种子（SDS法）、棉花黄化苗（SDS法）、棉花嫩叶（CTAB法）。

表1 不同方法提取不同材料DNA的浓度比较

2.2 DNA的OD260/280比较

对于棉花嫩叶和棉花黄化苗而言，所有方法的OD260/280都在1.8～2.2;对于棉花种子而言，只有SDS-CTAB法的OD260/280在1.8～2.2，且显著高于CTAB法和SDS法（表2）。

表2 不同方法提取不同材料DNA的OD260/280比较

2.3 DNA得率的比较

对于棉花嫩叶而言，获得DNA得率最高的方法是CTAB法，SDS法平均得率达到1 280 ng/mg以上;对于棉花种子而言，获得DNA得率最高的方法是SDS法，CTAB法平均得率达到3 160 ng/mg以上;对于棉花黄化苗而言，获得DNA得率最高的方法是SDS法，CTAB法平均得率达到1 624 ng/mg以上。这3种试验材料获得DNA得率最低的都是SDS-CTAB法，其平均值都低于1 000 ng/mg（表3）。

表3 不同方法提取不同材料DNA的得率比较

对于3种试验材料的得率最高值而言：棉花种子（SDS法）>棉花黄化苗（SDS法）>棉花嫩叶（CTAB法）。

对所有试验材料所有方法而言，得率排在前3位的方法是棉花种子（SDS法）、棉花黄化苗（SDS法）、棉花种子（CTAB法）。

2.4 不同方法和不同材料提取棉花DNA的PCR检测

由图1可知，不同方法提取不同材料DNA清晰程度由高到低为叶（SDS-CTAB）>种（SDS-CTAB）>黄（SDS-CTAB）>叶（CTAB）>种（SDS）>叶（SDS）>黄（CTAB）>种（CTAB）>黄（SDS）。

图1 不同方法和不同材料提取棉花DNA的PCR检测结果

3 讨论

（1）若后续试验对DNA的量没有要求，则棉花嫩叶、种子、黄化苗等组织都应选用SDS-CTAB法提取DNA;若后续试验材料有限，或对提取DNA的量有一定要求（如浓度需大于100 ng/μl，质量大于20 000 ng等），则这3种棉花组织都不能用SDS-CTAB法提取DNA。由于电泳图结果不理想，以下方法不推荐作为提取棉花组织DNA的方法：棉花种子（CTAB法）、棉花黄化苗（SDS法）。

对提取DNA的量有一定要求的情况，即不考虑SDS-CTAB法：对于棉花嫩叶而言，CTAB法在DNA浓度、OD260/280、DNA得率、电泳图清晰度方面，都明显优于SDS 法。所以对于棉花嫩叶，在对提取DNA的量有一定要求的情况下，推荐选用CTAB法。

对于棉花种子而言，CTAB法由于电泳图结果不理想而不被推荐使用。SDS 法虽然OD260/280较低，但DNA浓度、DNA得率非常高，且电泳图清晰，符合试验要求。所以对于棉花种子，在对提取DNA量有一定要求的情况下，推荐选用SDS法。

对于棉花黄化苗而言，SDS法由于电泳图结果不理想而不被推荐使用。CTAB法在DNA浓度、OD260/280、DNA得率、电泳图清晰度方面，都符合试验要求，所以在对提取DNA的量有一定要求的情况下，推荐选用CTAB法。

（2）棉花黄化苗（CTAB法）提取DNA浓度较棉花嫩叶（CTAB法）和棉花种子（CTAB法）虽然略低，但由于其样品质量较棉花嫩叶小，所以其得率与棉花嫩叶（CTAB法）没有显著差异，且其OD260/280在1.8～2.2，虽然其电泳图效果符合试验要求且清晰程度优于棉花种子（CTAB法），但不如棉花嫩叶（CTAB法）。

棉花黄化苗（SDS法）提取DNA浓度和得率较棉花嫩叶（SDS法）高，较棉花种子（SDS法）低，且其OD260/280在1.8～2.2，但其电泳图清晰度不符合试验要求且都不如棉花嫩叶和棉花种子SDS法的电泳图清晰。

棉花黄化苗（SDS-CTAB法）提取DNA浓度较棉花嫩叶（SDS-CTAB法）和棉花种子（SDS-CTAB法）高;提取DNA得率较棉花嫩叶（SDS-CTAB法）高，与棉花种子（SDS-CTAB法）没有显著差异。且其OD260/280在1.8～2.2，电泳图清晰度符合试验要求。

虽然棉花黄化苗（SDS法）提取DNA的OD260/280在1.8～2.2，但其PCR及电泳结果不符合试验要求;而棉花种子（SDS法）提取DNA的OD260/280不在1.8～2.2，但其PCR及电泳结果符合试验要求。所以OD260/280与PCR及电泳结果之间没有必然的联系。

SDS-CTAB法浓度普遍偏低是因为在加入氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提前就已离心，大大减少了杂质对DNA纯度的影响，使得提取的3种试验材料DNA样品的OD260/280平均都在2.0以上。但这一步离心也使得部分DNA被当作沉淀弃掉，导致SDS-CTAB法提取的DNA浓度很低。

转基因棉花的安全性评价需要对其基因漂移的距离和频率进行检测，而提取棉花DNA是检测基因漂移的必要步骤，快速高通量的提取棉花DNA并对其进行检测有利于提高效率。专门针对提取棉花DNA的试剂盒昂贵，不适合高通量的检测[16]，且对棉花叶子的检测需要先在室内发苗，检测周期长[13，17]，用棉花种子（SDS法）直接检测可以缩短检测周期，提高工作效率，该试验也为快速高通量地检测转基因棉花基因漂移距离和频率提供了参考。

参考文献

[1] 2013年棉花产业大事记[J]. 中国棉花，2014，41（1）：7.

[2] CLIVE JAMES. 2013年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势[J].中国生物工程杂志，2014，34（1）：1-8.

[3] 赵志辉， 杨立桃， 艾晓杰，等. 转codA基因的耐盐碱水稻对大鼠生理代谢的影响及外源基因的水平转移[J]. 农业生物技术学报， 2005， 13（3）： 341-346.

[4] 朱家林，贺娟，牛建群，等. 风向因素对转基因抗虫棉花基因漂移效率的影响[J].生态学报，2013，33（21）：6803-6812.

[5] 宋国立，崔荣霞，王坤波，等. 改良CTAB法快速提取棉花DNA[J].棉花学报，1998，10（5）：273-275.

[6] 谭燕华，彭存智，王冬梅.棉花DNA提取方法综述[J].安徽农业科学，2011，39（32）：19684-19685，19688.

[7] 孙鑫，崔洪志，胡宝忠，等. SDS-CTAB结合法提取棉花总DNA[J].生物技术通报，2004（5）：45-47.

[8] 曲延英，张强，孔祥祯，等. 4种快速提取棉花总DNA方法的比较[J].新疆农业大学学报，1999，22（4）：320-322.

[9] 沈法富，于元杰，刘凤珍，等. 棉花核DNA的提取及其RAPD分析[J].棉花学报，1996，8（5）：246-249.

[10] 陈翠霞，于元杰，王洪刚.棉花DNA的快速提纯[J].山东农业大学学报，1996，27（3）：353-355.

[11] 蓝海燕，刘桂珍，王长海.棉叶总DNA提取的改良方法[J].棉花学报，2000，12（1）：53.

[12] 郭宝生，张辉，耿军义，等. 改良SDS法快速提取小样品量棉花总DNA及其纯化[J].棉花学报，2005，17（5）：320-封三.

[13] 刘峰，赵佩，徐子初，等. 一种适用于SSR-PCR的棉花干种子DNA快速简便提取方法[J].分子植物育种，2010，8（5）：981-986.

[14] 匡猛，杨伟华，许红霞，等. 单粒棉花种子DNA快速提取方法[J].分子植物育种，2010，8（4）：827-831.

[15] 王长永，刘燕，周骏，等. 花粉介导的转Bt基因棉花田间基因流监测[J].应用生态学报，2007，18（4）：801-806.

[16] 李忠旺，厚毅清，石有太，等. 棉花基因组DNA快速提取方法改良[J].甘肃农业科技，2012（4）：11-13.

[17] 朱振雷，束永俊，李勇，等. 大豆种子DNA快速提取方法的改良及应用[J].东北农业大学学报，2009，40（10）：60-63.

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