ERK12信号通路在紫杉醇诱导直肠癌细胞凋亡中的作用分析

方案提供参考价值，以进一步改善直肠癌患者远期预后。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究标本为直肠癌细胞系CX1。

1.2 方法

1.2.1 直肠癌细胞培养 直肠癌细胞系CX1的培养液为10%胎牛血清（经30 min灭活）和庆大霉素12 U/mL，培养液温度56 ℃，放于培养箱内培养。培养箱温度37 ℃、饱和湿度、5% CO2，进行传代培养，选取对数生长期细胞开展研究。

1.2.2 两种药物方案的敏感性检测 应用MMT（噻唑蓝）检测紫杉醇+ERK12信号通路抑制剂PD98059和紫杉醇对直肠癌细胞的敏感性。具体方法为：在96孔板上接种直肠癌细胞，浓度为1×105个/mL。先放在培养液中培养4 h，观察细胞贴壁后，将96个孔板分为两组，其中一组加入浓度为10 μmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L的紫杉醇，另一组加入ERK12信号通路抑制剂PD98059后在加入不同浓度的紫杉醇。两组均继续培养72 h，在培养至69 h时于每个孔板中加入20μL MMT，4 h后将上清液吸出，加入100 DMSO，充分混匀后，使用酶标仪在570 nm波长处检测细胞的OD值，计算两组的直肠癌细胞生长抑制率。计算公式为：抑制率=（1-存活率）×100%，存活率為两组OD值的比值与10%的乘积。

1.2.3 直腸癌细胞周期解析 在6孔板上接种直肠癌细胞，浓度为1×106个/mL。在每个孔板中加入3.5 mL培养液，之后分别加入浓度为10 μmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L的紫杉醇和ERK12信号通路抑制剂PD98059。于加入PD98059后24、48 h收集细胞，在收集的细胞中加入冷PBS，以1000 r/min的速度离心5 min，洗涤2次，加入体积比为70%的4 ℃乙醇过夜，在1000 r/min的速度离心5 min，洗涤2次，加入100 μL碘化丙啶，放在4 ℃闭光的环境中染色30 min，应用流式细胞及配套软件对细胞周期进行解析。

1.3 观察指标 本研究选取的关注指标包括：（1）不同药物浓度下（10 μmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L），紫杉醇、紫杉醇+ERK12信号通路抑制剂PD98059作用72 h的直肠癌细胞抑制率；（2）紫杉醇、紫杉醇+ERK12信号通路抑制剂PD98059作用24、48 h直肠癌细胞凋亡率。

1.4 统计学处理 使用SPSS 20.0版本统计学软件建立数据分析模型，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用例（%）描述，比较采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同药物浓度下两种药物方案作用72 h的直肠癌细胞生长抑制率比较 10 μmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L浓度下，紫杉醇+ERK12信号通路抑制剂PD98059作用72 h的直肠癌细胞生长抑制率均较单独应用紫杉醇高（P<0.05），见表1。

2.2 两种药物方案作用24、48 h的直肠癌细胞凋亡率比较 在高倍镜下观察紫杉醇+ERK12信号通路抑制剂PD98059作用24、48 h的直肠癌细胞凋亡情况，随机选取视野内100个细胞统计两种药物方案的细胞凋亡率，结果显示紫杉醇+ERK12信号通路抑制剂两个作用时间点的直肠癌细胞凋亡率均高于单独应用紫杉醇（P<0.05），见表2。

3 讨论

紫杉醇为我国临床治疗卵巢癌和乳腺癌的常用药物，其本质是红豆杉属植物中的一种结构复杂的次生代谢产物，也是目前我国医疗领域上使用的唯一可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物[8-10]。药理研究证实该种药物的微蛋白结合十分稳定，能够抑制微管正常的力学重组，并能影响细胞的正常分裂，从而能够抑制细胞内某些调控因素对微管的作用，诱导细胞凋亡[11]。近年来的临床研究均报道该种药物在卵巢癌和乳腺癌患者临床治疗中的应用，能够获良好的临床疗效，但关于该药物在直肠癌患者临床治疗中的应用，却鲜有报道[12-13]。动物实验研究结果显示，紫杉醇对荷瘤裸鼠具有明显疗效，同时也发现ERK信号传导系统会对紫杉醇治疗荷瘤裸鼠的疗效产生影响[14-15]。

ERK是介导机体内细胞反应的重要信号传导系统，普遍存在于多种哺乳动物体内，该信号通路能够将细胞信号逐级扩大传入细胞内，将细胞外的刺激物和细胞内的细胞质、细胞核中的效应分子连接，对于细胞的生长和分化具有促进作用[16-18]。现阶段，我国临床研究最多的ERK信号通路为ERK12，主要研究内容为该信号通路对恶性肿瘤患者疾病治疗效果的影响[19]。直肠癌手术治疗术后复发率高，我国临床尚缺乏能够改善直肠癌患者术后远期预后的有效治疗方案[20]。本研究旨在通过明确ERK12信号通路在紫杉醇诱导直肠癌细胞凋亡中的作用，对现有的直肠癌治疗方案进行改建。研究结果显示紫杉醇+PD98059作用下的直肠癌细胞生长抑制率、凋亡率均明显高于单用紫杉醇。分析ERK12信号通路影响紫杉醇治疗直肠癌疗效的作用机制为：直肠癌细胞受到外南街刺激后能够机会ERK1，促使ERK12发生磷化，细胞浆转移至细胞核对，激活细胞核内的下游底物，介导一些原癌基因的活化，对细胞的生长产生调控作用，促使癌细胞的浸润和转移。

对上述研究结果进行分析，本研究认为ERK12信号通路会对紫杉醇治疗直肠癌的疗效产生影响，通过抑制ERK12信号通路，能够增强紫杉诱导直肠癌细胞凋亡的作用。但由于现阶段我国临床同类临床研究报道较少，本院本次研究过程中的操作有待进一步规范，因此本研究所得结果仍需更多研究学者进行大量实践研究验证。

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（收稿日期：2017-03-08） （本文编辑：周亚杰）

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