SRSF2在宫颈病变中的表达及其与HPV16感染的关系

【摘要】 目的：研究SRSF2在宫颈鳞状细胞癌及宫颈上皮内病变中的表达及其与HPV16感染的关系。方法：应用免疫组织化学En Vision法检测SRSF2蛋白在慢性宫颈炎、LSIL、HSIL、宫颈鳞状细胞癌组织中的表达情况。结果：SRSF2蛋白在慢性宫颈炎、LSIL、HSIL、宫颈鳞状细胞癌组织中高表达率分别为0（0/35）、7.14%（5/70）、29.17%（21/72）、67.27%（37/55）。随着宫颈上皮的病变程度增加，SRSF2蛋白的表达水平呈上升趋势。慢性宫颈炎与LSIL比较差异无统计学意义（P>0.05），其余各组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。HPV16在慢性宫颈炎、LSIL、HSIL、宫颈鳞状细胞癌组织中阳性表达分别为0（0/35）、11.43%（8/70）、41.67%（30/72）、76.37%（42/55），各组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。SRSF2蛋白表达与HPV16感染呈正相关（r=0.756，P<0.001）。结论：SRSF2蛋白的阳性率随宫颈病变的发展呈增高趋势，SRSF2蛋白表达与HPV16感染呈正相关，提示HPV16与SRSF2有协同致瘤作用，SR靶点可能成为HPV相关的宫颈肿瘤治疗新途径。

【关键词】 宫颈鳞状细胞癌； 宫颈上皮内病变； SRSF2蛋白； HPV16

【Abstract】 Objective：To study the expression of SRSF2 in cervical squamous cell carcinoma and cervical intraepithelial lesion and its relationship with the infection of HPV 16.Method：Immunohistochemistry En Vision method was used to detect the expression of SRSF2 protein in chronic cervicitis，low squamous intraepithelial lesion（LSIL），high squamousintraepithelial lesion（HSIL） and cervical squamous cell carcinoma tissues.Result：The strong positive rates of SRSF2 protein in chronic cervicitis，LSIL，HSIL and cervical cancer were 0（0/35），7.14%（5/70），29.17%（21/72），67.27%（37/55）.The expression level of SRSF2 protein showed uptrend with the increase of the degree of cervical epithelial lesions.There was no significant difference between chronic cervicitis and LSIL（P>0.05），but the difference between the other groups was statistically significant（P<0.05）.The positive expression of HPV16 in chronic cervicitis，LSIL，HSIL and cervical squamous cell carcinoma tissues were 0（0/35），11.43%（8/70），41.67%（30/72），76.37%（42/55）.The differences between groups were statistically significant（P<0.05）.The expression of SRSF2 protein was positively correlated with HPV16 infection（r=0.756，P<0.001）.Conclusion：With the development of cervical lesions，the positive rate of conclusion SRSF2 protein is increased，the expression of SRSF2 protein is positively associated with HPV16 infection，suggesting that HPV16 and SRSF2 have synergistic tumorigenic effect，SR may become a target of HPV related cervical cancer treatment in new ways.

【Key words】 Cervical squamous cell carcinoma； Cervical intraepithelial lesion； SRSF2 protein； HPV16

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.20.008

高危型人乳头状瘤病毒（HPV）能引起生殖器肿瘤（如子宫颈癌）、头颈部肿瘤、口咽癌等。人乳头瘤病毒16型（HPV16）是最常见的高危型HPV。HPV的发生是由两种病毒癌基因E6、E7驱动的[1]，活动期E6/E7 mRNA的转录可以产生两种癌蛋白（E6和E7蛋白），癌蛋白可与宿主细胞的细胞周期调节蛋白（抑癌蛋白如p53、RB等）相结合，导致细胞周期控制失常，发生癌变[2]。丝氨酸/精氨酸丰富（SR）蛋白[SR剪接因子（srsfs）]是调控构和选择性剪接的关键分子，正确和精确的剪接是野生型蛋白表达的关键[3]。文献报道SRSF2与MDS[4]、CMML[4]、PMF[5]等血液系统疾病的临床表型和预后密切相关，而在实体肿瘤中鲜有报道。本研究应用免疫组织化学染色法研究SRSF2在宫颈鳞状细胞癌和宮颈上皮内病变中的表达，术前或活检前均经过高危型HPVE6/E7 mRNA检测及HPV16、18/45基因型检测，研究HPV16感染在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变中的表达，并分析SRSF2的表达与HPV16感染的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月-2016年12月在山西医科大学第一临床医院手术或经过活检后存档的石蜡包埋的慢性宫颈炎、低级别鳞状上皮病变（low squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高级别鳞状上皮病变（high squamousintraepithelial lesion，HSIL）和宫颈鳞状细胞癌标本232例，年龄44～76岁，平均年龄52岁，其中慢性宫颈炎35例，LSIL 70例，HSIL 72例，宫颈鳞状细胞癌55例。所有患者术前或活检前均经过高危型HPVE6/E7 mRNA检测及HPV16、18/45基因型检测，所有患者术前均未进行抗肿瘤治疗。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学En Vision法 将蜡块标本切成2 μm厚，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3%H2O2去除内源性酶，高压处理热修复抗原，加一抗（兔单克隆抗体SRSF2，Abcam，ab204916）后4 ℃过夜，PBS冲洗后滴加二抗，室温条件下DAB显色，中性树胶封片。PBS液做阴性对照。

1.2.2 将采集的宫颈细胞样本用APTIMA法进行高危型HPVE6/E7mRNA检测及HPV16、18/45基因型检测，由自动化检测平台Panther直接出结果。

1.3 判定标准 免疫组织化学阳性信号呈棕黄色。SRSF2阳性部位定于细胞核，根据染色程度和染色细胞百分率进行组织学评分：深棕黄色为3分，棕黄色为2分，淡棕黄色为1分，细胞基本不着色为0分；阳性细胞率≥51%为3分、26%～50%为2分、6%～25%为1分、≤5%为0分。阳性细胞率评分与每张切片着色程度的乘积为最后得分：0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～6分为阳性（++），6分以上为强阳性（+++），将阴性和弱阳性统一判定为低表达，阳性和强阳性统一判定为高表达。在双盲条件下，每张切片由两名病理医师分别计数并进行结果判断。

1.4 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计数资料以率（%）表示，采用 字2检验、Spearman秩和检验等方法进行数据处理。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SRSF2在不同宫颈病变组织中的表达 SRSF2在慢性宫颈炎中无阳性表达，随着宫颈上皮病变程度增加，SRSF2的表达水平呈上升趋势，在LSIL、HSIL、宫颈鳞状细胞癌高表达率分别为7.14%（5/70）、29.17%（21/72）、67.27%（37/55）。SRSF2在慢性宫颈炎与LSIL高表达率均明显低于HSIL和宫颈鳞状细胞癌，不同宫颈病变两两比较，慢性宫颈炎与LSIL比较差异无统计学意义（P=0.167>0.05），其余各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1和表1。

2.2 HPV16在不同宫颈病变组织中的表达 HPV16在慢性宫颈炎、LSIL组、HSIL组、宫颈鳞癌组阳性表达率分别为0（0/35）、11.43%（8/70）、41.67%（30/72）、76.37%（42/55）。不同宫颈病变组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 SRSF2蛋白表达与HPV16感染的相关性 相关性分析结果显示：在各宫颈病变组织中SRSF2蛋白的阳性表达与HPV16感染（阳性）呈正相关（r=0.756，P<0.001）。见表3。

3 讨论

近年来由于检测技术和诊断水平的提高以及人们防治癌症意识的增强，宫颈癌在大多数发展中国家的发病率有所下降[6]，但是每年仍有近30万妇女死于宫颈癌，而子宫颈上皮内病变的发病率呈逐年上升趋势。HPV的感染在宫颈上皮内瘤变最终演进为浸润癌的过程中发挥着关键的作用，高危型如HPV-16持续感染的HSIL病例，发展为浸润癌的几率更大[7]。HPV相关肿瘤的发生是由HPV E6和E7癌蛋白驱动的。APTIMA HPV16、18/45基因型检测法是一种针对致癌基因E6/E7 mRNA来检测HPV16、18/45的方法。本研究发现HPV16在慢性宫颈炎组织中几乎无表达（0/35），而在LSIL、HSIL、宫颈鳞状细胞癌组阳性表达率较高（分别为8/70、30/72、42/55），提示HPV16感染与高级别病变和宫颈鳞状细胞癌的发生发展有密切关系，与相关研究结果一致。

丝氨酸/精氨酸丰富（SR）蛋白[SR剪接因子（srsfs）]调控mRNA的转录、加工、输出、稳定及翻译等。目前发现的有9种经典的SR蛋白，命名为SRSF1至SRSF9[8]。SR蛋白家族成员的过度异常表达在多种肿瘤的发生、发展中至关重要[9]。Fischer等[10]研究表明SRSFl、SRSF2和SRSF3在恶性卵巢组织肿瘤中高表达，与其进展密切相关。Stickeler等[11]研究显示SRSFl、SRSF2和SRSF6在乳腺癌中高表达。Mole等[3]的研究结果表明SRSF1、SRSF2、SRSF3在宫颈鳞状细胞癌中高表达，而SRSF2能促进HPV16阳性宫颈鳞状细胞癌的发生发展，沉默SRSF2能够导致癌细胞克隆减少、细胞凋亡增加，这说明SRSF2在宫颈鳞状细胞癌的发生发展中起重要作用。本研究结果显示，宫颈鳞状细胞癌组织与HSIL组织中SRSF2的高表达率（37/55、21/72）均显著高于LSIL和慢性宫颈炎组织中（5/70、0/35），与Mole等[3]的相关研究一致；在慢性宫颈炎与LSIL SRSF2的高表达率（0/33、5/70）比较差异无统计学意义（P>0.05），而LSIL与HSIL及HSIL与宫颈鳞状细胞癌SRSF2的高表达率比较差异均有统计学意义（P<0.05或<0.01），这提示SRSF2可能成为预测宫颈癌前病变的一个重要标志物。

Melanie等[12]证明靶向沉默SRSF2导致HPV16 E6/E7mRNA显著降低，使宫颈癌细胞增殖增长减速。有研究表明，SRSF2可以直接调节转录延伸[13]，也能调节关键转录因子SP1的表达，而SP1能反式激活HPV16 P97启动子[14]。此外，SRSF2还能提高E6E7mRNA的稳定性[15]，可能与以下机制有关：当HPV基因组插入到宿主基因组时，3端癌蛋白RNA的加工发生在整合点下游的宿主基因组的多聚腺苷酸化位点，这样SRSF2就可以直接选择性地剪接的病毒/基因组基因整合点下游区外显子或3端非翻译区[16]；SRSF2还能与其同源部位如相关微管蛋白Tau蛋白结合[17]，而Tau蛋白能够防止mRNA的降解，提高E6/E7 mRNA的稳定性；E6/E7重组双顺反子mRNA的5端含有提前终止密码子，而SRSF2可以通过靶向调节E6/E7mRNA的无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）途径[18]防止提前终止密码子介导的E6/E7蛋白的生成减少。这些均提示SRSF2在HPV16阳性宫颈癌细胞中的致癌性及两者间的协同致瘤作用。目前SRSF2在髓系肿瘤中的研究较多，而在实体肿瘤中鲜有报道，其作用机制复杂[19]。本研究结果显示，SRSF2蛋白的表达与HPV16感染存在明显的正相关，在HSIL、宫颈鳞状细胞癌中HPV的阳性率高达41.67%（30/72）、76.37%（42/55），而在HPV阳性的HSIL和宫颈癌组织中SRSF2高表达的病例数所占比例高达70.00%（21/30）、88.10%（37/42），進一步证实了SRSF2在HPV16阳性宫颈病变的发生发展中的重要作用。由于SR蛋白活性抑制剂是一个成熟的相关抗病毒药物的靶点，调节SR激酶的药物已经成功地应用于抑制HIV和丙型肝炎病毒的复制[20]，这很有可能成为HPV相关的肿瘤治疗新途径。

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