骨桥蛋白和CD44v6在恶性黑素瘤中的表达及其意义

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1.1 标本采集

所有标本选自笔者所在医院病理科1999-2010年的石蜡包埋标本28例。其中，恶性黑素瘤16例（转移性黑素瘤12例，原位黑素瘤4例），男10例，女6例，年龄42～76岁，平均（56.2±4.72）岁，全部患者术前均未接受化疗。良性黑素痣组织12例，男7例，女5例，年龄32～57岁，平均（36.7±5.92）岁。

1.2 试剂

鼠抗人OPN单克隆抗体、鼠抗人CD44v6单克隆抗体均购自美国Santa Cruz生物技术有限公司，兔抗鼠二抗、免疫组化标准化试剂盒和DAB显色试剂盒由浙江大学呼吸病学研究所王苹莉博士惠赠。

1.3 免疫组化

所有标本由10%甲醛固定，石蜡包埋，切片5μm厚，分别行普通HE染色和免疫组化特染，所有实验操作步骤按照说明书进行。比如，免疫组化具体步骤为：石蜡切片脱蜡至水，3%双氧水室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡2次，每次5min。5%～10% 正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，4℃过夜。PBS冲洗3次，每次5min。滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育 10-30min。PBS冲洗3次，每次5min。滴加适量辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃ 孵育10～30min。PBS冲洗3次，每次5min。DAB显色3～15 min。自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

1.4 结果判定

在胞质或胞膜中可见棕黄色颗粒为阳性细胞，否则为阴性。根据阳性染色细胞的百分数及其染色深浅强度进行分级评判。阳性染色细胞的百分数分级：阳性细胞≤5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；≥50%为3分。染色深浅强度：无染色为0分，轻度染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分。以上两项相乘为分级标准：（-）为0-1分；（+）为2-3分；（++）为4-6分；（+++）为9分。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件，采用χ2检验进行两两间比较，应用Spearman等级相关对两种分子在恶黑组织中的表达情况及两者的相互关系进行分析。以α=0.05作为检验水准，当P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE结果

HE染色可见，恶性黑素瘤组织的基底层可见不典型的黑素细胞连续增生。表真皮交界处肿瘤细胞呈巢，部分巢融合真皮中下部弥漫性增生，肿瘤细胞异形明显，核大而深染，细胞形态大小不一，见图1。

2.2 OPN、CD44v6在恶性黑素瘤和良性黑素痣中的表达

OPN在16例恶性黑素瘤患者标本中有14例（87.5%）表达阳性，其中5例为弱阳性，6例为中度，剩余3例为强阳性，阳性颗粒主要见于细胞浆内，呈小片状以及巢状分布；CD44v6在16例恶性黑素瘤患者标本中有12例（75.0%）表达阳性，其中4例为弱阳性，6例为中度，2例为强阳性，阳性颗粒主要见于细胞膜上，偶见细于胞浆内（图2）。12例良性黑素痣组织中有2例（16.7%）OPN表达阳性，均为弱阳性。12例良性黑素痣未见CD44v6表达阳性（表1）。OPN和CD44v6在恶性黑素瘤的表达与在良性黑素痣中的表达相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。

2.3 OPN和CD44v6在恶性黑素瘤组织中表达的相关性

14例阳性表达OPN的患者中有12例CD44v6表达呈阳性，2例阴性表达OPN的患者中CD44v6阳性和阴性表达各占1例，两者为正相关（r=0.69，P<0.05（表1））。

2.4 OPN和CD44v6的表达与恶性黑素瘤是否发生转移的关系

在16例恶性黑素瘤患者标本中，OPN在12例转移黑素瘤中的表达高于4例原位黑素瘤，两者之间差异有统计学意义（χ2=4.16，P<0.05）。在16例恶性黑素瘤患者标本中，CD44v6在12例转移黑素瘤中的表达亦高于4例原位黑素瘤，两者之间差异有统计学意义（χ2=3.96，P<0.05）。其中，在12例转移黑素瘤病例中，OPN和CD44v6全部表达阳性，而4例原位黑素瘤中，OPN有2例表达阳性，2例表达阴性，CD44v6则全部表达阴性。详见表2。

3 讨论

OPN是一种分泌型磷酸化糖蛋白，具有多种生物学活性，并受到多种激素和细胞因子的调控。大量研究表明，OPN能够促进肿瘤细胞的趋化、黏附和迁移，与多种肿瘤的发生、发展、浸润、转移和复发有关[1]。OPN与细胞的结合力是通过细胞表面的受体所介导。OPN的受体家族主要包括整合素和CD44。OPN可通过细胞粘附序列RGD识别整合素αvβ3与细胞表面结合，也还可以与细胞表面的跨膜糖蛋白CD44 相互作用，OPN与CD44的相互作用可增高其CD44依赖的趋化性，引起粘附和抗凋亡作用[3-5]。研究表明，OPN在恶性肿瘤中的主要受体是CD44v，OPN协同CD44v在各种肿瘤中的高表达能够增加其与ECM的黏附，促进肿瘤的转移，越有转移潜能的病变，OPN的表达就越显著[2，4]。

Zhou等[6]的研究发现了近200个与恶黑远处转移相关的基因，其中14个基因的表达超过正常个体20倍，Opn基因也名列其中。在蛋白质层面，Philip等[7]研究发现，利用小干扰RNA技术使得黑素瘤细胞OPN的表达沉默后，可以显著抑制细胞的增殖活性，而使用人乳中的OPN刺激B16黑素瘤细胞后，其增殖能力大增。以上结果足以表明，OPN在黑色素瘤这个疾病的发展和转移中发挥了重要作用，将来有可能作为其特征性的标记分子[8]。

笔者研究结果提示，在恶性黑素瘤中，OPN与CD44v6均有较高的阳性表达率，且明显高于良性黑素痣。该结果与国内外关于单独研究OPN在黑素瘤中的作用报道相一致[9，10]。此外，OPN与CD44v6的表达呈正相关，说明OPN与CD44v6可能通过某种协同效应，OPN表达增强的同时能够提高CD44v6的表达。当肿瘤细胞表面这两种分子的表达量达到一定量时，能够使肿瘤细胞的黏附和转移相对变得更为轻松，在其它因素的共同作用下，发生远处转移。笔者下一步还需要研究其具体的病理机制。

笔者还发现，转移性恶性黑素瘤病例中OPN和CD44v6表达阳性率和染色强度均高于原位黑素瘤病例（P<0.05），提示两者的共同高表达可能与恶性黑素瘤的高度转移能力有关，尤其是CD44v6，它作为淋巴细胞的“归巢受体”，可以使淋巴细胞与毛细血管后小静脉中的内皮细胞发生结合，并使淋巴细胞穿过血管壁回到淋巴组织，因此，发生转移的恶黑病例中CD44v6表达阳性率显著增高[11]。黄长征等[9]的研究也认为，OPN参与恶性黑素瘤的侵袭和转移，但并非通过淋巴结转移。有研究推测，可能因为恶性黑素瘤的侵袭和转移非常快，肿瘤尚未发生淋巴结转移时即已发生其他形式的转移[12]。

[参考文献]

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[6]Zhou Y，Dai DL，Martinka M.et al.Osteopontin expression correlates with melanoma invasion[J].J Invest Dermatol， 2005，124：1044-1052.

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[11]姜鹏爽，周之海，陈旭，等.骨桥蛋白和CD44v6在乳房外Paget病中的表达及其生物学意义[J].中国皮肤性病学杂志，2010，24（11）：1003-1006.

[12]Kumar S，Sharma P，Kumar D，et al.Functional characterization of stromal osteopontin in melanoma progression and metastasis[J].PLoS One.2013，8（7）：e69116.

[收稿日期]2015-05-16 [修回日期]2015-07-29

编辑/张惠娟

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