类风湿关节炎患者外周血miR—146a及miR—155的表达及临床意义

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【摘 要】目的：探讨类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞中miR-146a及miR-155的表达及临床意义。方法：应用实时荧光定量PCR法检测30例类风湿关节炎患者及30例健康者外周血淋巴细胞中miR-146a、miR-155的表达水平，并且与类风湿关节炎患者红细胞沉降率、C-反应蛋白、DAS28评分、免疫球蛋白M型类风湿因子进行相关性分析。结果：miR-146a及miR-155在类风湿关节炎患者外周血淋巴细胞中的相对表达水平均高于对照组，且差异有统计学意义（P < 0.05）。类风湿关节炎患者miR-146a、miR-155的表达水平与红细胞沉降率、C-反应蛋白、DAS28呈正相关（P < 0.05），与免疫球蛋白M型类风湿因子无相关性（P > 0.05）。结论：类风湿关节炎患者外周血miR-146a和miR-155表达上调，其表达水平与类风湿关节炎病情活动相关，提示miR-146a和miR-155可作为类风湿关节炎疾病活动的有效指标。

【关键词】 关节炎，类风湿；外周血；miR-146a；miR-155

【ABSTRACT】Objective：To investigate the expression and clinical significance of miR-146a and miR-155 in peripheral blood lymphocytes of patients with rheumatoid arthritis.Methods：The real time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression levels of miR-146a and miR-155 in peripheral blood lymphocytes of 30 cases of rheumatoid arthritis and 30 healthy people.A correlation analysis was made between above detected levels and patients’ erythrocyte sedimentation rate，C-reactive protein，DAS28 score and immunoglobulin M rheumatoid factor.Results：The relative expression levels of miR-146a and miR-155 in the peripheral blood lymphocytes of patients with rheumatoid arthritis were higher than those of the control group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.The expression levels of miR-146a and miR-155 were positively correlated（P < 0.05）with erythrocyte sedimentation rate，C-reactive protein and DAS28 and had no correlation（P > 0.05）with immunoglobulin M rheumatoid factor.Conclusion：The expression of miR-146a and miR-155 in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis up-regulates and the expression level is related to disease activity，suggesting that miR-146a and miR-155 can be used as effective indicators of disease activity of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；peripheral blood；miR-146a；miR-155

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种主要侵犯全身各处关节，同时其他器官或组织也可受累的慢性全身性自身免疫性疾病。主要病理改变为多发性、对称性、慢性增生性滑膜炎，可以引起关节软骨和关节囊的破坏，最后导致关节强直畸形[1]。miRNAs是一类长约20～24个核苷酸的非编码RNA，通过对基因表达转录后调控，从而参与很多生物学过程。近年来的研究表明，miR-146a及miR-155分子在RA患者中异常表达，与RA的起病和发展有着密切的关系，miR-146a及miR-155能否成为新型生物标记物而应用于临床已成为研究热点[2]。本研究通过检测miR-146a及miR-155在RA患者外周血的表达水平，并结合临床相关指标，分析其与RA疾病活动程度相关性，初步探讨miR-146a及miR-155在RA发病及疾病进展中的

意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年12月至2016年3月在湖北民族学院附属民大医院风湿免疫科就诊的门诊及住院RA患者30例，男9例，女21例；年龄33～59岁，中位数48.6岁。所有患者均符合1987年美国风湿病学会（ACR）RA分类诊断标准[3]。选择同期在本院体检的30例健康者作为对照组，男10例，女20例；年龄30～60岁，

中位数46.1岁。2组均排除糖尿病、高血压、心脏病、恶性肿瘤及其他自身免疫性疾病。2组患者在性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本实验得到当地伦理委员会支持，且所有参与者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 人外周血淋巴细胞分离液（天津灏洋公司）；miRcute miRNA Isolation Kit及miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit（TIANGEN公司）；SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司）；miR-146a、miR-

155、U6引物（TIANGEN公司）；实时荧光定量PCR仪（LC480，瑞士）。

1.3 外周血淋巴细胞（PBMCs）提取 抽取RA患者及正常人外周血2 mL，取2 mL PBS液与血液1∶1混匀后，沿管壁小心加于4 mL淋巴细胞分离液面上，置于1500 r·min-1离心机离心20 min。

此时可见试管中不同组分的条带，从上至下分别为血浆层，淋巴细胞层（乳白色），分离液层和红细胞层。用移液器轻轻吸取淋巴细胞层，置于1.5 mL

无RNA酶的离心管中，加适量的PBS稀释，置于2000 r·min-1离心机离心10 min洗涤，弃上清，用PBS再洗1次，白色沉淀即为淋巴细胞。

1.4 miRNA提取 向每支装有PBMCs的EP管中加入1 mL裂解液MZ，混匀，室温放置5 min，加入200 μL氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡15 s，室温放置5 min后，4℃，置于12 000 r·min-1离心机离心15 min，样品分3层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，把水相转到新的无RNA酶的离心管中。严格按照miRNA提取试剂盒说明书进行操作。

1.5 miRNA cDNA第一链合成 取5 μL miRNA加入到20 μL体系中。严格按照miRNA cDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录。合成的cDNA置于-20 ℃保存备用。

1.6 实时荧光定量PCR 反应体系20 μL：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）10 μL，PCR Forward Primer（10 μM） 0.4 μL，PCR Reverse Primer

（10 μM） 0.4 μL，Template 2 μL，dH2O 7.2 μL。

以上操作均在冰上进行，反应条件：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40个循环。每个样本目的基因，即miR-146a和miR-155的CT值分别用各自的内参基因（即U6）进行归一化处理，即△CT样本 = CT目的基因

- CT内参，分别得到△CT实验样本和△CT对照样本值，然后计算两者差值，即△△CT = △Ct样本-△Ct对照，最后计算2-△△CT，其表示实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。

1.7 28个关节疾病活动度评分（DAS28） 参照Prevoo等[4]的计算方法，DAS28评分由以下参数计算得出：肿胀关节数（SJC）、压痛关节数（TJC）、红细胞沉降率（ESR），计算公式为：DAS28=（0.56×sqrt TJC+0.28×sqrt SJC+0.7×lnESR）×1.08 + 0.16。

1.8 ESR、C-反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白M（IgM）型类风湿因子（RF）的测定 ESR、CRP、IgM型RF分别采用魏氏法、免疫比浊法、ELISA法检测，以上指标检测结果由湖北民族学院附属民大医院检验科提供。

1.9 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）；miR-146a、miR-155表达水平与各指标的关系采用Person相关分析。以P < 0.05

为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-146a、miR-155在RA患者及健康者PBMCs

的表达水平 miR-146a及miR-155在RA患者PBMCs中的相对表达水平分别是对照组的2.436倍

及1.982倍，且差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 miR-146a及miR-155的表达与RA患者ESR、CRP、DAS28评分及IgM型RF的相关性

RA患者miR-146a、miR-155的表达水平与ESR、CRP、DAS28呈正相关（P < 0.05），与IgM型RF无相关性（P > 0.05）。

3 讨 论

Bhanjia等[5]首次发现在RA患者的血浆中存在抗GW小体的自身抗体，GW与miRNAs介导的mRNA降解和翻译抑制有关，并发现一些miRNA在RA患者的外周血单核细胞、关节液、关节滑膜组织及滑膜成纤维细胞中上调，其中包括miR-146a及miR-155。陈岩等[6]研究认为，miR-146a、miR-155均与天然免疫和适应性免疫细胞的生成有关，在某些免疫性炎症性疾病或炎症环境中会过表达，可能通过下调toll/白细胞介素-1（IL-1）受体信号下游分子，进而负反馈对免疫反应及炎症反应做出微调。

miR-146前体经加工后有2种形式：miR-146a和miR-146b。Nakasa等[7]发现，RA患者滑膜组织中的成熟miR-146a和初始miR-146a/b的表达量明显高于骨关节炎患者。miR-146a主要在滑膜组织表面和衬里层表达。同时在RA滑膜成纤维细胞中miR-146a/b经IL-1和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激后明显上调。尹志华等[8]发现，miR-146a在RA患者PBMCs和血浆中的表达水平均高于对照组，表明在RA患者滑膜细胞、组织及外周血中miR-146a的异常表达，可能与miRNAs的免疫调节作用有关。近年来研究报道，miR-155在免疫反应中有着极为重要的生物学作用。Pauley等[9]发现，RA患者PBMCs中miR-155的表达水平是健康对照组的1.8倍。于萍等[10]发现，RA患者滑膜成纤维细胞（SFs）中miR-155的表达明显高于骨关节炎患者，且miR-155可抑制RASFs中基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的分泌，因此认为，miR-155可以通过下调特定MMPs分子的表达来抑制RASFs增殖和降低侵袭能力，减少组织损伤，这也为RA提供了有前景的治疗方向。以上研究表明，miR-146a及miR-155与RA的发生、发展密切相关。

ESR、CRP是判定RA炎症活动度和病情缓解的可靠指标。DAS28评分是判定RA活动程度的通用标准。IgM型RF约见于85%～95%的RA患者，是临床诊断的重要指标[11]。测定血清ESR、CRP、IgM型RF结合DAS28评分，更能反映RA患者病情状况。

本研究检测30例RA患者及30例健康者PBMCs中miR-146a及miR-155的表达，发现miR-146a及miR-155在RA患者的表达水平均高于健康者，与国外学者的研究结果一致，miR-146a及miR-155表达显著上调可能与RA中丰富的炎性细胞因子有关。进一步研究miR-146a及miR-155表达水平与ESR、CRP、DAS28评分及IgM型RF的相关性，发现RA患者miR-146a、miR-155的表达水平与ESR、CRP、DAS28呈正相关，与IgM型RF无相关性，这提示miR-146a及miR-155的表达上调与RA病情活动性相关。

综上，本研究认为，miR-146a和miR-155在RA患者PBMCs中的表达水平与RA病情活动性相关，可作为RA疾病活动的有效指标，对RA病情严重程度的判断有一定价值。为了进一步阐明miR-146a和miR-155在RA发病机制中的作用，笔者将会加大样本量深入研究，为RA的诊断和治疗提供新的思路。

4 参考文献

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[5]Bhanjia RA，Eystathioya T，Chan EK，et al.Clinical and serological features of patients with autoantibodies to GW/P bodies[J].Clin Immunol，2007，125（3）：247-256.

[6]陈岩，秦阳华.miRNA在类风湿关节炎中作用的研究进展[J].现代免疫学，2013，33（1）：77-80.

[7]Nakasa T，Miyaki S，Okubo A，et al.Expression of MicroRNA-146 in rheumatoid arthritis synovial tissue[J].Arthritis Rheum，2008，58（5）：1284-1292.

[8]尹志华，叶志中，孙华麟，等.类风湿关节炎患者外周血单个核细胞和血浆中miR-155和miR-146a的表达[J].中华风湿病学杂志，2012，16（9）：620-624.

[9]Pauley KM，Satoh M，Chan AL，et al.Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients[J].Arthritis Res Ther，2008，10（4）：R101.

[10]于萍，龙丽，王世瑶，等.miR-155在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达及功能研究[J].中华风湿病学杂志，2010，14（7）：460-463.

[11]乐爱平，赵旭兰，张经宇.Ⅰ型胶原吡啶交联终肽在类风湿关节炎患者血清中测定的临床意义[J].中华风湿病学杂志，2005，9（8）：485-487.

收稿日期：2016-05-17；修回日期：2016-07-20

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