P,-选择素对黑色素瘤细胞整合素β1表达的影响

[摘要] 目的:研究P-选择素对黑色素瘤细胞整合素β1表达的影响,探讨P-选择素在肿瘤转移中的作用。方法:培养黑色素瘤细胞B16F10,在加或不加p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB203580的情况下,用P-选择素蛋白进行刺激,用蛋白质印迹(Western Blot)检测刺激后B16F10细胞整合素β1蛋白表达及p38 MAPK信号分子磷酸化水平的改变,用MTT法检测黏附细胞数目的变化。结果:P-选择素刺激B16F10细胞导致p38 MAPK磷酸化水平增高,整合素β1表达上调,用特异性阻断剂阻断p38 MAPK活化可以抑制P-选择素的诱导作用。MTT检测结果显示P-选择素刺激可增加细胞与整合素β1配基纤维粘连蛋白的黏附能力,说明细胞整合素β1表达增高。结论:P-选择素可以通过激活p38 MAPK途径诱导黑色素瘤B16F10细胞整合素β1的表达,提高肿瘤细胞的黏附能力,这可能是其促进肿瘤转移的机制之一。

[关键词] P-选择素;整合素β1;p38丝裂原活化蛋白激酶;肿瘤

[中图分类号] R730.23 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)06(c)-013-03

Effects of P-selectin on the expression of β1 integrin in melanoma cells

LI Ming1, CHEN Weiqiang1, LI Yan2, LUO Shaohong1, WANG Weizhang1

(1. School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical College, GuangdongProvince, Guangzhou510006, China;2. School of Basic Medical Science, Guangzhou University of Chinese Medicine, GuangdongProvince,Guangzhou510006, China)

[Abstract] Objective: To investigate the effects of P-selectin on the expression of integrin β1 and the phosphorylation of p38 MAPK in melanoma cell line B16F10. Methods: B16F10 cells were treated with P-selectin in the presence or absence of SB203580, an inhibitor of p38 MAPK. The protein expression of integrin β1 and the phosphorylation level of p38 MAPK were determined by Western Blot. Cell adhesion was detected by MTT assay. Results: P-selectin significantly enhanced the expression of integrin β1 in B16F10 cells and the phosphorylation level of p38 MAPK. Inhibit p38 MAPK by SB203580 suppressed P-selectin-induced integrin β1 expression. Treated with P-selectin also enhanced the adhesion of B16F10 cells to fibronectin. Conclusion: P-selectin might effectively up-regulated integrin β1 expression in melanoma cells via p38 MAPK pathway, which may contribute, in part at least, to the tumor metastasis.

[Key words] P-selectin; Integrin β1; p38 MAPK; Tumor

转移是肿瘤患者死亡的主要原因,寻找和研究与肿瘤转移密切相关的分子是防治肿瘤转移的关键[1]。肿瘤转移包括肿瘤细胞脱离原发部位、穿透毛细血管、在血液中的运输、黏附并跨血管壁转运到靶组织形成继发瘤等过程,其中肿瘤细胞与血管内皮细胞及细胞外基质的黏附是肿瘤从血液到组织的关键[2]。选择素和整合素是重要的黏附分子,分别介导了白细胞的边集、黏附和游出。研究证实,肿瘤细胞游出血管的过程与白细胞类似,也是由黏附分子所介导的[3]。降低选择素或整合素基因表达可以抑制肿瘤的转移[4-5]。前期用基因敲除小鼠也发现敲除P-选择素基因可以抑制肿瘤的生长和转移[6]。本实验采用重组P-选择素蛋白刺激黑色素瘤细胞,观察P-选择素对整合素β1表达的影响和肿瘤细胞黏附能力的改变,探讨P-选择素在肿瘤转移中的作用。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器

P-选择素可溶性蛋白和对照蛋白(美国R&D公司); 纤维粘连蛋白(美国Calbiochem公司);SB203580(美国Sigma公司);蛋白提取试剂盒、ECL化学发光试剂盒(美国Pierce公司);抗整合素β1、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸化p38 MAPK和β-Actin抗体(美国Santa Cruze公司),MTT(广州合达生物公司)。酶标仪、蛋白电泳仪、电转仪、杂交箱(美国Bio-Rad公司)。

1.2 细胞培养及干预实验

小鼠黑色素瘤细胞B16F10为本室保存,用含10%小牛血清的DMEM培养基传代培养。生长状态良好的B16F10细胞经胰酶消化后,调整细胞浓度为5×105/ml,1 ml/孔接种到6孔培养板内,待细胞生长至80%融合后,用PBS清洗2次,更换培养液,加入P-选择素蛋白(终浓度为10.50 mg/L)和对照蛋白(终浓度为50 mg/L)或先加入SB203580(终浓度10 μm)30 min后再加入蛋白进行刺激。实验分组如下:①空白对照组,加入等体积的培养基;②阴性对照组,加入对照蛋白;③P-选择素组,加入P-选择素蛋白。根据实验要求在相应时间点取细胞进行后继实验。

1.3 P-选择素对整合素β1蛋白表达的影响

B16F10细胞加入刺激物后继续培养6 h,以冰冷PBS终止刺激,按照试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取20 μg样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳,转膜,5%的脱脂奶粉37℃封闭1 h,加抗整合素β1(1∶500)或抗β-Actin(1∶1 000)单克隆抗体,4℃孵育过夜,洗膜,加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液(1∶3 000) 37℃孵育1 h,ECL法显影。

1.4 P-选择素对细胞黏附能力的影响

细胞刺激6 h后,用胰酶消化,以2.5×104/孔接种到经20 mg/L纤维粘连蛋白包被的96孔培养板中,置于37℃、5%CO2条件下孵育90 min,用DMEM培养基洗涤3次,采用MTT比色法,在酶标仪上读取490 nm处的吸光度,代表各组细胞黏附的相对数目。

1.5 P-选择素对p38 MAPK磷酸化的影响

B16F10细胞加入刺激物后培养20 min,以冰冷PBS终止刺激,提取细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳,以抗p38 MAPK抗体(1∶1 000)和抗磷酸化p38 MAPK抗体(1∶500)为一抗进行蛋白质印迹(Western Blot),具体方法同上。

1.6统计分析

所有数据以x±s表示,采用SPSS 11.0统计软件对实验结果进行Student"s t检验分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1P-选择素对整合素β1蛋白表达的影响

Western Blot结果显示,在无外源性刺激的情况下B16F10细胞整合素β1表达较低,对照蛋白刺激对整合素β1表达无明显影响,而P-选择素刺激可以上调整合素β1蛋白表达。结果还显示,用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580预处理30 min可以抑制P-选择素诱导的整合素β1表达,提示P-选择素的诱导作用与其激活p38 MAPK信号途径有关。结果见图1。

Fig.1Up-regulate integrin β1 expression in P-selectin-stimulated B16F10 cells

1. 空白对照组;2. 阴性对照组;3. P-选择素组(10 mg/L);4. P-选择素组(50 mg/L);5. P-选择素(50 mg/L)+SB203580

2.2 P-选择素对B16F10细胞黏附能力的影响

MTT检测结果显示,对照蛋白刺激对黏附的B16F10细胞数目无显著影响,P-选择素刺激后黑色素瘤B16F10细胞黏附数目增多(P<0.05)。由于96孔板预先用纤维粘连蛋白包被,而纤维粘连蛋白是整合素β1的配基,因此,推测P-选择素促进黑色素瘤细胞的黏附可能与其上调整合素β1表达有关。用SB203580可以抑制P-选择素诱导的整合素β1的表达,同样也减少了与纤维粘连蛋白黏附的肿瘤细胞数目。结果见表1。

表1P-选择素对B16F10细胞黏附能力的影响(x±s,n=3)

Tab.1Effects of P-selectin on the adhesion of melanoma cells to fibronectin(x±s,n=3)

2.3 P-选择素对p38 MAPK磷酸化水平的影响

Western Blot结果显示,空白对照组细胞内处于活化状态的p-p38 MAPK含量较少,用对照蛋白刺激p-p38 MAPK含量无明显改变,10 mg/L和50 mg/L浓度的P-选择素刺激均可导致细胞内p-p38 MAPK含量明显增加,说明P-选择素刺激导致p38 MAPK被磷酸化激活。结果见图2。

3 讨论

转移是肿瘤患者死亡的主要原因之一,也是目前肿瘤治疗中的难题。寻找在肿瘤转移中起关键性作用的分子,是肿瘤防治研究的重点。在肿瘤的转移中,肿瘤细胞与血管内皮细胞、细胞外基质的黏附是肿瘤穿出血管壁在局部形成转移灶的前提[7]。目前认为选择素和整合素在这个过程中占有重要地位,抑制其表达可以降低肿瘤的转移[8]。最近,在对白细胞的研究中发现P-选择素与配体的结合除了介导白细胞的边集外,还可以引起整合素的激活,促进整合素介导的细胞黏附和游出过程[9-11]。研究发现肿瘤细胞表面的糖蛋白(如CD24、CD44等)可作为P-选择素的配体,与血管内皮细胞上的P-选择素结合,介导肿瘤细胞的边集,促进肿瘤转移[3,12]。笔者和其他研究者均证实抑制P-选择素表达,可以减少肿瘤的转移[5-6]。在对整合素的研究中也得到了类似的结果,减低选择素表达,可以减少肿瘤的转移[5]。

选择素和整合素除了介导肿瘤细胞和血管内皮细胞黏附外,还介导了炎症过程中白细胞的游出。近年来,在对白细胞的研究中发现P-选择素和配基结合后可以诱导整合素表达,促进整合素介导的白细胞黏附和游出[9-11]。关于在肿瘤细胞与血管内皮细胞黏附过程中,P-选择素与配基的结合是否也导致了肿瘤细胞上整合素的激活,本研究针对此问题,采用P-选择素蛋白刺激黑色素瘤细胞B16F10,用Western Blot研究肿瘤细胞上整合素β1表达变化,发现刺激后肿瘤细胞上整合素β1表达增高,提示在肿瘤细胞上也存在P-选择素对整合素的诱导效应。用整合素的受体纤维粘连蛋白包被细胞培养板,发现P-选择素刺激后肿瘤细胞与纤维粘连蛋白的结合能力增强,进一步证实了P-选择素对整合素β1的诱导作用。本实验还从p38 MAPK信号分子入手,观察其磷酸化水平的改变,初步探讨了P-选择素诱导整合素β1表达的机制。实验结果显示,P-选择素刺激后,B16F10细胞内磷酸化的p38 MAPK含量增多;用p38 MAPK信号通路阻断剂SB203580预先干预30 min,可以抑制P-选择素诱导的整合素β1表达,上述结果表明p38 MAPK参与了P-选择素的诱导作用。

综上所述,P-选择素与配基的结合除了直接介导肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附外,还可以通过p38 MAPK信号途径增强整合素的表达,增强肿瘤细胞的黏附力,这可能是P-选择素促进肿瘤转移的作用机制之一,该结果为以P-选择素为靶点的抗肿瘤治疗提供了理论依据。

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(收稿日期:2010-05-18)

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