基因编辑的发展历程

材料证明CRISPR-Cas确是一种细菌获得性免疫系统。这一突破立刻引起许多科学家高度重视，因此想进一步探索其作用机制。2008年，两个研究小组发现CRISPR.Cas系统在发挥免疫机制的作用时确实可转录出RNA，即crRNA（CRISPR-related RNA）。crRNA有引导作用，然而它们更多识别的是DNA，而非当初假说认为的RNA。Cas蛋白有核酸内切酶活性，多种Cas蛋白联合可特异性地剪切与crRNA互补的DNA而形成双链断裂。该发现重要性显而易见，crRNA负责识别，Cas蛋白负责DNA剪切，两者具有用于基因编辑的两项基本能力。不过已发现的两类CRISPR-Cas系统（Ⅰ型和Ⅲ型）均较复杂，特别是进行DNA剪切时需多个Cas9蛋白共同作用，而ZFN和TALEN都只需一种嵌合核酸酶即可，因此应用优势并不明显。

2011年，瑞典于默奥大学（Umefi University）微生物研究中心法国微生物学家沙尔庞捷（E.M.Charpentier）和同事在研究Ⅱ型CRISPR-Cas系统时发现，crRNA参与DNA识别还需反式激活的CRISPR来源的RNA（trans-activating CRISPR-derived RNA，tracrRNA）协助。这虽会增加RNA的需求数量（而RNA操作相对容易），但执行DNA剪切时只需一种Cas9蛋白即可。此新型CRISPR-Cas系统还吸引了美国加州大学伯克利分校结构生物学家杜德娜（J.A.Doudna），她与沙尔庞捷共商改造Ⅱ型系统。

2012年，杜德娜和沙尔庞捷联合小组将crRNA和tracrRNA两种RNA二合一，形成单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA），其中crRNA部分负责与靶DNA配对识别，而tracrRNA负责维持空间结构，在RNA指导的核酸酶（RNA-guided nuclease，RGN）Cas9催化下，完成对靶DNA双链的特异剪切。2013年，哈佛大学的张锋和丘齐（G.M.Church）研究小组采用这套系统，在细胞内完成靶基因编辑。

CRISPR-Cas9相对于传统的嵌合核酸酶技术，优点显而易见。首先是设计简单，摈弃了嵌合酶技术的蛋白质结构域DNA识别设计理念，随之用符合沃森一克里克配对的理念进行sgRNA设计。其次在操作方面，传统嵌合酶设计在识别结构域后还要与核酸内切酶剪切结构域连接，如果有多个靶DNA的编辑，就需要多次的融合。CRISPR-Cas9在Cas9保持不变前提下只需要对sgRNA进行操作，因此在同时进行多基因编辑方面更显高效。CRISPR-Cas9由于具有高效简便的特点，一经发现便引发了一场基因编辑研究的热潮，这项技术迅速风靡全世界。

DNA介导的DNA编辑（ssDNA-Ag0）

1998年，美国法尔（A.Z.Fire）和梅洛（C.C.Mello）在合作研究线虫肌肉相关蛋白质的生物学功能过程中，发现同时注入针对该基因的正义RNA和反义RNA能起干扰基因表达的作用，此现象被称为RNA干扰（RNA interference，RNAi）。2006年，法尔与梅洛为此分享诺贝尔生理学或医学奖。

RNA干扰现象的发现，激发了随后对其作用机制的研究。原来，双链RNA首先被加工为21～23个核苷酸的双链RNA，然后其中一条链与靶mRNA及相关因子形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencing complex，RISC），完成对mRNA的剪切，而Argonaute（Ago）蛋白是RISC的一种关键成分。

Ago蛋白最初在模式植物拟南芥中发现，由于基因突变体形态非常类似于软体动物船蛸（Argonautaargo）而得名。随后从果蝇、小鼠和人等发现Ago普遍存在。Ago蛋白拥有一个C端Piwi结构域，具RNA核酸内切酶活性，从而对靶mRNA实现剪切。进一步研究发现，不仅真核生物而且包括细菌和古菌在内的原核生物亦普遍存在Ago蛋白。借鉴CRISPR.Cas9研究经验，研究人员提出，原核生物Ago蛋白也参与细菌免疫机制，意味着也能用于基因编辑。

2014年，荷兰瓦赫宁根大学（WageningenUniversity and Research Centre）范德奥斯特（J.van der Oost）发现古菌——噬热栖热菌（Thermusthermophilus）的Ago蛋白（TtAgo）还具有DNA核酸内切酶活性，但和Cas9不同，TtAgo剪切靶DNA时依赖单链DNA（single stranded DNA，ssDNA）而不是RNA，说明Ago蛋白是一种DNA指导的核酸酶（DNA-guided nuclease，DGN）。此发现在阐明一种新型原核生物的免疫系统作用机制同时，还显示ssDNA-Ago系统也可应用于基因编辑。然而，该技术的应用前景尚待进一步确定。鉴于三大类生物分子DNA、RNA和蛋白质的生物学作用特征，即DNA是遗传信息携带者，蛋白质是生物学功能具体执行者，而RNA更多发挥中介和调节等多重生物学作用（近几年生命科学进展更多出现在RNA领域，包括核酶、RNA干扰等），功能多样的RNA作为引导分子，可能比DNA在基因编辑方面具有优势。当然，此推测需要充分的实验加以证实。

基因编辑的应用

基因编辑工具更多地引入DNA双链断裂（DSB），由于机体对DNA完整性的要求，因此随后会启动修复机制。DNA修复系统主要有两种类型，分别为非同源末端连接（non-homologous end ioininz.NHEJ）和同源指导的修复（homology-directedrepair，HDR）。NHEJ无需同源序列，可将断裂的双链重新连接，然而在连接过程中会出现碱基丢失或增加，最终造成基因的缺失或插入突变。HDR是在同源DNA存在前提下，以同源DNA信息为模板完成DNA断裂处修复。如果按基因打靶策略在引入双链断裂的同时补充打靶序列，可实现精确替换，既可引入定点突变，又可实现突变基因的修复。基因编辑通过对目标DNA的精确操作，达到控制生物性状和行为的目的，因此拥有广泛的应用前景。

首先，可作为便捷的实验工具。实验室基因功能研究的快捷方法是RNA干扰技术，但RNA干扰只影响mRNA含量，并未去除基因本身，而传统基因敲除由于费事费钱，其应用受到限制。当前的基因编辑技术可快速制备突变体，加快了实验研究进程。

其次，用于模式生物制备。用传统基因打靶技术制备的模式动物，一方面效率低，另一方面还受限于干细胞；而用最新基因编辑技术已完成大量物种的基因敲除，制备出各种特定疾病的动物模型，并且时间大大缩短。采用CRISPR-Cas9等技术不仅能对传统模式动物如小鼠、大鼠等进行基因编辑，还能在大型哺乳动物如猪和牛以及猴等灵长动物中开展基因编辑。

第三，用于物种改良。新的基因编辑技术对动植物改良有重要意义，如借助CRISPR-Cas9完成对猪体内病毒的去除工作等多方面的应用。

第四，具有潜在的临床价值。最新的基因编辑技术已在遗传病、血液病和感染病等领域显示了巨大临床价值，还为其他疾病的诊治提供了重要借鉴。当然尚需进一步的探索以保证应用的安全性。

第五，用于其他领域。通过对现有技术的改造，可望在基因表达调控等领域也发挥重要作用。

基因编辑的前景

基因编辑从原理上讲只有一种类型，就是借助核酸酶实现DSB，但根据DNA序列特异识别机制的差异，可分为两大类，即嵌合酶技术（如ZFN和TALEN等）和核酸指导的核酸酶技术（CRISPR-Cas9和ssDNA-Ago等）。基因编辑的演变历史也基本沿着细菌-免疫系统-核酸酶这一线索展开。

由基因编辑发展历程可见科学发展一般规律。第一代基因编辑为单组分（天然核酸内切酶或人工嵌合核酸酶），第二代基因编辑为双组分（引导核酸加核酸内切酶），突破性进展在于用精确碱基配对取代蛋白质一DNA识别。但两代技术均存在一个重大缺陷，就是需要原核核酸内切酶，意味着应用于临床存在诱发机体免疫应答的潜在危险。因此推测，是否有诞生第三代基因编辑的可能？即重回单组分，但此时已不是蛋白质而是RNA。RNA本身既具有识别作用，有时又具有核酸内切酶活性（核酶），这样既减少了多组分困扰，又避免了外源蛋白质（对已有基因编辑技术必不可少）的不利影响。当然，这想法能否实现还要深入研究。

基因编辑研究分四个层面，即体外实验、细胞水平、动物水平和临床应用。目前研究人员已在前三个层面取得重大突破，对其临床应用也充满期待。然而。真要把基因编辑应用于临床，目前仍有许多问题要解决，如怎样提升体内基因编辑过程中的转染和编辑效率，怎样避免潜在的脱靶效应及不确定因素影响，此外还涉及伦理问题，须进一步完善相关技术，尽可能避免不良效应。上面提到DSB的引入，这也意味着正常情况下细胞内DSB发生率极低，暗示引入过多DSB对细胞可能是颇大威胁，为基因编辑安全性埋下了隐患。

总之，基因编辑技术犹如双刃剑，我们在看到其快速发展和广阔应用前景同时，也要理性估计其应用的得失，尤其对未来可能的临床应用更宜采取慎重态度。

关键词：基因编辑 基因打靶 锌指核酸酶 TALEN CRISPR-Cas9 ssDNA-Ago

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