激活AMPK通过下调microRNA⁃21水平抑制肺癌细胞增殖及侵袭能力

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一、细胞株和试剂选择

人A549肺腺癌细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，二甲双胍购自Selleck，Compound C 购自Merck Millipore ，RNA提取试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司，逆转录试剂盒及TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司，PTEN、p⁃Akt、t⁃Akt、p⁃AMPK、t⁃AMPK、GAPDH抗体购自CST，细胞培养板购自Corning，PCR扩增仪及Western电泳仪购自BIO⁃RAD，MTT试剂购自西唐生物科技有限公司。

二、试验方法

1. 细胞培养

A549细胞用含有10%灭活胎牛血清，青霉素（100 U/ml），链霉素（100 μg/ml）的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。

2.   噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞活性

将处于对数生长期的A549细胞消化贴壁细胞后，加入含10%血清的培养基，制成单细胞悬液并计数，以约6×103个/孔细胞数接种于96孔培养板中，将培养板放入37℃、5% CO2培养箱内孵育24 h，细胞全部贴壁后，弃去上清，取出96孔板，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl，然后置于37℃ 、5% CO2培养箱中继续孵育4 h，弃去上清，每孔加DMSO 150 μl，置于摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解;设定空白对照孔调零，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值（OD值）。并计算平均增殖率，增殖率=实验孔OD值/对照孔OD值×100%，整理保存数据。

3.   RT⁃PCR检测miR⁃21水平

用RNAfast1000⁃总RNA极速抽提试剂盒提取细胞总RNA，配制逆转录cDNA反应液用于miR⁃21及U6的检测，将逆转录好的cDNA稀释10倍至50 ng/μl以下应用BIO⁃RAD PCR實时定量扩增仪的操作方法进行反应，分析溶解曲线，计算结果。

4.   蛋白免疫印迹法检测细胞内PTEN及p⁃Akt水平

按实验设计干预细胞后提取蛋白，用BCA法测定蛋白含量、变性，SDS⁃PAGE电泳，转印后取出硝酸纤维素膜进行免疫反应，膜用滤纸吸干，将预先配制的发光液均匀滴上，BIO⁃RAD成像系统检测条带，分析结果。

5.   Transwell小室迁移及侵袭实验测定肿瘤细胞迁徙及侵袭能力

用Matrigel胶与无血清培养基按1∶7稀释，每个Transwell小室上加入100 μl稀释液，37 ℃孵育箱孵育 Transwell 小室至少1 h 使胶凝固，制备细胞悬液，在细胞培养箱中常规培养（迁移实验培养24 h，侵袭实验培养48 h），显微镜下取小室的上、下、左、右、中心5个视野部位计数，统计结果。

三、统计学处理

采用SPSS 18.0统计分析。正态分布数据以x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD⁃t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、二甲双胍抑制肺癌细胞的侵袭能力

将A549细胞分为对照组、二甲双胍组，进行Transwell迁移及侵袭试验，结果显示二甲双胍干预后，A549细胞的迁移及侵袭能力明显受到抑制。对穿膜细胞数计数后进行统计分析，组间差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

二、二甲双胍通过激活AMPK抑制肺癌细胞增殖和侵袭能力

将A549细胞分为对照组及二甲双胍组，提取细胞总蛋白，蛋白免疫印迹法检测各组细胞p⁃AMPK水平，与对照组比较，二甲双胍组p⁃AMPK水平明显升高（图2A，P<0.05）。预先给予AMPK抑制剂Compound C可抑制二甲双胍诱导的p⁃AMPK水平上调（P<0.05，图2B）。MTT检测细胞增殖情况，结果表明特异性抑制AMPK，二甲双胍抑制A549细胞增殖的作用被逆转（图2C，P<0.05，与二甲双胍组比较）。

预先给予AMPK抑制剂Compound C可逆转二甲双胍抑制A549细胞迁移及侵袭的能力。对穿膜细胞计数后进行统计分析，组间差异有统计学意义（图3，P<0.05，与二甲双胍组比较）。

三、激活AMPK抑制肺癌细胞增殖和侵袭能力的分子机制

1. miR⁃21水平

与对照组相比，二甲双胍干预可下调细胞中miR⁃21水平（P<0.05），而预先给予AMPK抑制剂Compound C可逆转二甲双胍对miR⁃21水平的影响（图4，P <0.05，与二甲双胍组比较）。

2. PTEN/PI3K/Akt信号通路

与对照组相比，二甲双胍干预可明显上调细胞中PTEN水平，而预先抑制AMPK可逆转二甲双胍对PTEN水平的影响;二甲双胍干预可下调A549细胞中p⁃Akt水平，而预先给予Compound C 可以逆转二甲双胍对p⁃Akt的抑制作用，见图5。

3.  miR⁃21介导了激活AMPK抑制肺癌细胞增殖的作用

为了进一步明确激活AMPK是否通过下调miR⁃21水平抑制A549细胞增殖。用miR⁃21 mimics转染A549细胞，培养48 h后提取总RNA，qRT⁃PCR检测细胞miR⁃21水平。结果表明miR⁃21 mimics可明显上调A549细胞中miR⁃21水平（图6A，P<0.05，与对照组比较）。二甲双胍处理可明显抑制A549细胞增殖（P<0.05，与对照组比较），而预先给予miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍抑制细胞增殖的作用（P<0.05，与二甲双胍组比较），见图6B。

为了进一步明确激活AMPK是否通过下调miR⁃21水平抑制A549细胞侵袭，将A549细胞分为对照组、二甲双胍组、miRNA mimics NC+二甲双胍组、miR⁃21 mimics +二甲双胍组，Transwell小室实验检测肺癌细胞迁移及侵袭能力。结果表明二甲双胍处理可明显抑制A549细胞迁移及侵袭，而预先给予miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍的抑制作用，对穿膜细胞计数后进行统计分析，组间比较差异有统计学意义（图7，P<0.05，与二甲双胍组比较）。

将A549细胞分为对照组、二甲双胍组、miRNA mimics NC+二甲双胍组、miR⁃21 mimics +二甲双胍组。miRNA mimics NC或miR⁃21 mimics 预转染细胞24 h，然后加入10 ml吡格列酮干预24 h，提取蛋白质，检测PTEN和p⁃/t⁃Akt水平。结果显示二甲双胍处理可上调PTEN水平，而预先给予miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍对PTEN水平的影响（图8A）。二甲双胍处理可下调p⁃Akt水平，而预先给予miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍对p⁃Akt水平的影响（图8B）。

讨 论

miR⁃21基因是最早在人类基因组中检测到的miRNA之一，在多种不同类型肿瘤组织中均明显上升，与肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭、血管生成和抗药性等生物学行为相关，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。近年来，miR⁃21在肺癌发病和治疗过程中的作用逐渐引起关注[5⁃9]。PTEN是miR⁃21的重要靶蛋白之一，miR⁃21可以通过下调PTEN水平诱导多种细胞增殖。PI3K/Akt信号通路参与细胞增殖、迁移、分化、血管生成等一系列病理生理过程。研究表明，Akt可通过磷酸化调控下游靶蛋白的活性或功能[10⁃11]。例如，Akt可磷酸化双微基因2蛋白，抑制p53蛋白的功能，促进细胞存活;可通过磷酸化BAD、FXKR抑制其生物活性，抑制细胞凋亡;促进NF⁃κB磷酸化，抑制细胞凋亡;可通过磷酸化mTOR，上调Skp2水平，下调p27，促进细胞增殖。本研究未系统检测Akt下游关键靶蛋白的活性变化，但大量的研究已建立了它们之间的相关性。

作为肿瘤重要的恶性生物学行为之一，迁移及侵袭加剧了肿瘤的发展进程，影响预后。研究发现在胰腺癌中miR⁃21表达的上调，加剧了肿瘤细胞的迁移及侵袭[12]。本研究中，Transwell实验结果证实过表达miR⁃21可以逆转二甲双胍对A549细胞迁移及侵袭能力的抑制作用。

综上所述，二甲双胍可通过激活AMPK下调miR⁃21水平，进而负性调控PTEN⁃PI3K/Akt信号通路抑制肺癌细胞增殖;此外，二甲双胍还可抑制肺癌细胞的侵袭能力，机制也與激活AMPK，下调miR⁃21水平有关，提示AMPK可能是防治肺癌的新靶点，但要应用于临床过程，尚需进一步研究、验证。

参 考 文 献

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（收稿日期：2018⁃07⁃10）

（本文编辑：杨江瑜）

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