NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其应用

摘 要 为获得稳定表达及较好免疫效力的重组NNV衣壳蛋白，对已公布的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列进行优化，并构建表达载体pET32a-NNV，于大肠杆菌BL21（DE3）中诱导、表达，将包涵体纯化后碾磨成粉添加到黄粉虫饲料中，用虫体粉末喂食石斑鱼，攻毒保护试验检测免疫效力。结果获得高表达的NNV衣壳蛋白包涵体，目的蛋白占总蛋白的比率达70%，纯化后纯度达95%；且喂食本技术制备的黄粉虫粉末后石斑鱼对NNV抵抗力显著提高，存活率由5%上升至83%。本研究提供一种重组NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中高效表达和纯化方法，为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推廣奠定了基础。

关键词 石斑鱼；神经坏死病毒；衣壳蛋白；疫苗

中图分类号：S943 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.06.063

石斑鱼是一种重要的经济鱼类。神经坏死病毒（NNV）可攻击石斑鱼的神经系统，造成致命性的病毒脑病和视网膜病变[1]，是鱼苗培育过程中重大病害之一。一旦爆发，会造成仔、稚鱼的大量死亡，成为制约石斑鱼养殖业发展的瓶颈。目前，应对方法主要是阻断传播途径、筛选未携带病毒的亲鱼以切断垂直传播、利用碘试剂等消毒方法以减少水平传播，但前者受检测灵敏度限制，后者无法确保消毒彻底，因此疫苗是防治石斑鱼神经坏死病的重要方法之一。至今已基于大肠杆菌、昆虫细胞和酵母系统成功表达NNV主衣壳蛋白，电镜下可见病毒样颗粒形成，动物实验显示其具有良好的免疫原性[2]。然而传统注射重组病毒样颗粒的免疫方法，虽然对较长鱼苗具有较好的免疫保护作用，但对特异性免疫还未成熟的石斑鱼稚苗来说，则很难达到防治的目的，因而通过开发口服类疫苗被动免疫稚鱼，将是针对稚鱼免疫系统特点的较为有效的一种预防措施[3]。

因此本研究以制备稳定表达以及较好免疫效力的NNV衣壳蛋白为出发点，利用基因工程技术获得高表达的NNV衣壳蛋白包涵体，并建立了一种操作简单、可行性强的喂食免疫方法，为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推广提供了可能性，具有广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

pET32a原核表达载体，大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）由本实验室保存。健康斜带石斑鱼（Epinephelus coioids）以及黄粉虫（Tenebrio molitor）均由福建水产研究所提供。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、连接试剂盒、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉、预染蛋白marker，均购自赛默飞；IPTG，购自麦克林。

裂解液：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol·L-1 NaCl、125 mmol·L-1 咪唑。缓冲液B1：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol·L-1 NaCl、1% TritonX-100。缓冲液B2：10 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 7.1）、100 mmol·L-1 NaCl。均由本实验室配制和保存。

1.1.3 仪器

超净工作台，购自AIRTECH；恒温摇床购，自上海智城分析仪器制造公司；均质机，购自AVESTIN；超速离心机，购自Thermo Scientific；电泳仪，购自Bio-Rad；凝胶成像仪，购自上海复日科技有限公司；冷冻干燥机，购自上海皓庄仪器有限公司。

1.1.4 培养基

液体培养基：LB培养基、氨苄青霉素抗性LB培养基（抗生素浓度为50 μg·mL-1）；氨苄青霉素抗性固体培养基：

LB液体培养基+1.2%琼脂粉（抗生素浓度为50 μg·mL-1）。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物设计

检索NCBI数据库得NNV衣壳蛋白基因序列（accession： KC696562.1），并对其进行优化，第15～18个氨基酸由TKAA变为RG。引物序列设计如下，上游引物：5’-CATGCCATGGTACGCAAAGGTGAGAAG-3’（划线部分为NcoⅠ酶切位点）；下游引物：5’-CCGCTCGAGTTAAGTGCAGACAGTGCC-3’（划线部分为XhoⅠ酶切位点）。基因和引物序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 PCR扩增目的基因

扩增条件为：95 ℃预变性3 min，设定每个循环为95℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，34个循环结束后72 ℃再延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用Omega胶回收试剂盒回收目的片段。

1.2.3 载体构建

将pET-32a载体与回收的PCR产物分别进行NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物于25 ℃连接2 h；连接产物全部转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，复苏后涂布于氨苄青霉素抗性固体培养基。随机挑取单克隆，使用Omega质粒小量抽提试剂盒提取质粒，对所提质粒作双酶切验证，取阳性结果提交苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.2.4 NNV衣壳蛋白的小量表达

将pET-32a-NNV转化大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取单菌落于6 mL氨苄青霉素抗性LB培养基中，37 ℃、250 r·min-1条件下培养，当OD600达0.6时，取500 μL作为种子液，37℃、220 r·min条件下过夜培养；剩余菌液降温至25℃，加入IPTG使其终浓度为1 mmol·L-1，于200 r·min-1恒温摇床中诱导表达12 h。诱导完成后取菌液离心，使用裂解液重悬菌体，超声破碎，离心取上清和沉淀利用SDS-PAGE分析NNV衣壳蛋白的表达情况。同时取种子液菌体做空白对照。

1.2.5 NNV衣壳蛋白发酵表达

种子液按1∶100比例接入500 mL氨苄青霉素抗性LB培养基中，37 ℃、250 r·min-1条件下恒温培养，当OD600达0.6时降温至25 ℃，加入IPTG使其终浓度为1 mmol·L-1，于200 r·min-1恒温摇床中诱导培养12 h。

1.2.6 NNV衣壳蛋白包涵体纯化

菌体使用裂解液重悬，高压均质机破碎，离心收集沉淀，1）加入缓冲液B1混匀，25 ℃振荡；2）离心弃上清，加入缓冲液B2混匀，25 ℃振荡；3）离心弃上清，加入纯水混匀，25 ℃振荡；4）重复步骤上一步骤两次；5）离心弃上清，取少量沉淀用裂解液重悬，SDS-PAGE分析，剩余沉淀冷冻干燥后碾磨，过80目筛，得NNV衣壳蛋白粉末。

1.2.7 虫体粉末制备

取3齡期黄粉虫，将NNV衣壳蛋白粉末按虫体平均体重的1%添加到黄粉虫饲料中喂食，培养至4龄期时，将虫体冷冻干燥，碾磨成粉末，过80目筛。

1.2.8 免疫效力检测

在2 000 L的放养池中放养健康斜带石斑鱼300尾，将虫体粉末按鱼体重1.5%添加到鱼饲料中喂食石斑鱼，每周喂食1次，共喂食3次。将感染了神经坏死病的石斑鱼加水打碎成浆后离心，以上清为攻毒源投入鱼池，16 d内每天统计鱼死亡数，以此计算存活率。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增目的基因

以人工合成的NNV衣壳蛋白目的基因序列为模板进行扩增，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后得约1 000 bp的条带，与预计的片段长度大小一致，如图1A所示。

2.2 pET-32a-NNV载体的构建和鉴定

载体和片段分别使用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切（图1B），回收后连接。挑单克隆过夜培养、提取质粒并进行双酶切验证，经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后可见线性化的载体下方有1 000 bp左右的条带（图1C），测序结果显示重组质粒pET-32a-NNV序列完全正确。

2.3 NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中的小量表达

诱导表达完成经离心收集菌体，重悬后超声破碎，分别取未诱导全菌、诱导后全菌、破碎后上清和破碎后沉淀样品进行SDS-PAGE鉴定，结果如图2A所示，对照未诱导全菌明显可见约58 kDa处条带，与预期融合表达标签的目的蛋白大小基本一致，证明NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中可高效表达，且以包涵体形式存在。

2.4 NNV衣壳蛋白发酵表达

由小量表达的结果进行扩大培养，取保存的种子复苏后按1：100比例接入摇瓶中，培养以及诱导条件与小量表达相同；经收集菌体、裂解液重悬、均质机破碎后，取全菌、破碎后菌体上清以及沉淀进行SDS-PAGE鉴定，结果如图2B中的1～3所示，可见目的蛋白约占总蛋白量的70%，且以包涵体形式存在于沉淀中。

2.5 NNV衣壳蛋白包涵体纯化

对NNV衣壳蛋白包涵体进行纯化，按顺序分别使用缓冲液B1、B2以及纯水与各步所得沉淀混匀后于25 ℃振荡30 min，最后离心取沉淀用裂解液重悬并进行SDS-PAGE鉴定，结果如图2B中的4，可见纯化后NNV衣壳蛋白包涵体纯度达95%。剩余沉淀经冷冻干燥、碾磨、过80目筛获得NNV衣壳蛋白粉末。

2.6 虫体粉末制备

正常喂食以及将NNV衣壳蛋白粉末作为饲料添加剂喂食的黄粉虫分别代表对照组和实验组。两组除饲料成分有差别外，其他条件均相同。进而分别将两组虫体冷冻干燥后碾磨成粉得对照组和实验组虫体粉末。

2.7 免疫效力检测

喂食对照组和实验组黄粉虫粉末的石斑鱼分别对应对照组和免疫组石斑鱼，两组石斑鱼除饲料成分有差别外，其他条件均相同。3次喂食后进行攻毒保护试验，攻毒源投入后，一些鱼类出现神经紊乱症状并伴有螺旋式游泳，对16 d内石斑鱼存活率进行统计，结果见表1。随时间的延长，两组石斑鱼存活数量均有下降，而16 d后实验组石斑鱼存活率达83%，对照组却仅为5%。对16 d内两组石斑鱼数量对比，表明喂食本技术制备的NNV衣壳蛋白粉末的石斑鱼对NNV抵抗力较对照组明显提高，能有效抵抗神经坏死病症。

3 讨论

随着石斑鱼人工繁育技术的突破，我国石斑鱼工业化养殖不断发展，但长期存在的神经坏死病毒对石斑鱼养殖业造成严重威胁，应对措施主要是阻断病毒的垂直传播和水平传播，但均存在安全隐患；提高病毒检测灵敏度是重要的研究方向之一，目前已建立PCR法、ELISA、细胞培养以及组织病理方法等检测、诊断技术，但实际情况下受到检测特异性、细胞培养以及制备病毒抗体等方面的限制[4]。另有报道使用天然免疫增强剂作为饵料添加或直接抛洒，但多为辅助手段，因此在石斑鱼鱼苗的培育过程中，疫苗是防治神经坏死病症的重要方法，相对传统灭活苗，基因工程疫苗成本低、免疫原性好、安全性高的优点显著，是疫苗研发的重要方向，目前研究主要集中在亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗以及DNA疫苗的制备。

本研究利用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达NNV衣壳蛋白，pET表达质粒含有强启动子，可相对较高效表达外源蛋白，因此本实验根据前期实验结果，采用pET32a载体，并对NNV衣壳蛋白氨基酸序列进行优化，最终获得以包涵体形式存在的高表达的目的蛋白，融合表达的蛋白分子量约为58 kDa，相对于可溶性表达的目的蛋白，其优势在于大大提高了表达量，同时具有高稳定性的特点，为工业化生产提供了可能[5]。

然而传统注射免疫方法操作繁琐，大规模使用受限，而口服类疫苗操作简单、可行性强，并且可针对稚鱼免疫系统特点，被动免疫稚鱼，是目前较理想的一种预防措施。因此，本研究对NNV衣壳蛋白包涵体进行纯化、冷冻干燥得衣壳蛋白粉末，将喂食NNV衣壳蛋白粉末的黄粉虫作为石斑鱼饲料添加剂，操作简单，可行性强，攻毒保护试验得出本研究使用的免疫技术对石斑鱼具有良好的免疫保护性效果，能有效抑制石斑鱼神经坏死病。且本技术所涉及的黄粉虫养殖，操作简单、周期短、成本低、节省空间；另黄粉虫养殖不传播疾病，无需防疫。此外与注射免疫的方法相比，喂食免疫方法可行性强，仅在常规饲料中多添加喂食NNV衣壳蛋白的黄粉虫粉末一种原料即可实现明显免疫效果，极大地提高了工作效率。

4 结论

本研究成功实现了石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的高效稳定表达，同时基于NNV衣壳蛋白包涵体，采用喂食免疫法实现对石斑鱼的免疫防治，为实行石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化奠定了基础。

参考文献：

[1]Nakai T， Mori K， Sugaya T， et al. Current knowledge on viral nervous necrosis （VNN） and its causative betanodaviruses[J].The Israeli journal of aquaculture-Bamidgeh，2009，61（3）：198-207.

[2]陈文捷，刘晓丹，胡先勤，等.鱼类神经坏死病毒研究进展与发展趋势[J].水产学报，2014，38（9）：1666-1672.

[3]Thorarinsson R， Powell D B. Effects of disease risk， vaccine efficacy， and market price on the economics of fish vaccination[J].Aquaculture，2006，256（1-4）：42-49.

[4]刘滨，刘新富，曾霖，等.七带石斑鱼神经坏死病毒的RT-LAMP检测方法[J].天津农业科学，2016，22（7）：23-28.

[5]陈晓艳，翁少萍，殷志新，等.斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化[J].中山大学学报（自然科学版），2005，44（6）：83-86.

（责任编辑：刘昀）

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