响应面法优化CTF619—D菌株液体发酵工艺研究

摘要：为了提高CTF619-D发酵液中的代谢物质浓度，获得更多有效抗菌活性成分，采用响应面法对菌株的发酵条件进行优化。结果表明，CTF619-D菌株的最佳发酵条件为摇床转速119.33 r/min、装液量109.75 mL、温度26.78 ℃。

关键词：放线菌;发酵;优化;响应面分析

中图分类号：TS201.3        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）12-2867-04

Liquid Fermentation Process Optimization for CTF619-D by Response Surface Method

KANG Jing-qin1， LV Yue-dong， TAO Lin2， WANG Yong1， LIU Yang1， ZHANG Liang1

（1.Liaoning University of Science and Technology， Anshan 114051，Liaoning，China;2.Shenyang Normal University， Shenyang 110034，China）

Abstract： In order to improve the concentration of metabolites in CTF619-D fermentation broth for more effective antimicrobial active ingredient the liquid fermentation conditions for CTF619-D were optimized by response surface method. The  optimum fermentation conditions were： shaking speed of 119.33 r/min， liquid volume of 109.75 mL， and temperature of 26.78 ℃. The inhibition zone diameter was up to 27.58 mm under optimized conditions.

Key words： actinomycetes; fermentation; optimization; response surface analysis

放线菌是具有巨大使用价值的一类微生物，是抗生素的主要生产菌，是新医药、新农药和生物防治活菌剂研制的源头[1]。目前，已知的抗生素大约有80%来自于放线菌，其产生的抗生素具有抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、抗寄生虫等多种活性[2]。在植物病害生物防治中，拮抗微生物主要是链霉菌属及其相关类群[3]。据报道，淡紫灰链霉菌是一类重要的抗生素产生菌， 其产生的医用抗生素如薰衣草菌素、链丝菌素和农用抗生素如中生菌素等都已有广泛的用途[4]。目前，国内关于拮抗淡紫灰链霉菌鉴定的诸多研究中，除淡紫灰链霉菌海南变种外，未见有其他淡紫灰链霉菌变种的报道。因此，CTF619-D是一株有价值的具生物活性的生防菌株，期待进一步开发其在瓜果蔬菜病害防治领域中的应用。本试验以菌株CTF619-D为发酵菌种，用响应面法对菌株的发酵条件进行优化[5]，以实现试验次数的最小化和多因素交互作用分析，并建立变量与响应量之间的模型，预测最优的条件和结果，从而获得该菌代谢产生有效抗菌活性成分的最优发酵参数，为该菌株在工业上大量生产代谢物质提供一定的实践基础和理论依据。

1材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株  供试菌株为放线菌菌株CTF619-D（由辽宁科技大学生物试验室分离、筛选并保存）;指示菌株为番茄炭疽菌、黄瓜炭疽菌、苹果腐烂菌等植物病原菌，由辽宁科技大学生物制药工艺室提供。

1.1.2  仪器  HZQ-C型空气浴振荡器（哈尔滨市东明医疗仪器厂）、SPX-250B-G型光照培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、TGL-16C型高速离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）;ZHWY-2102型恒温培养振荡器（上海向帆仪器有限公司）、ES-315型高压灭菌锅（杭州科晓化工仪器设备有限公司）、T-203型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、SW-CJ-5型超净工作台（南京庚辰科学仪器公司）等。

1.2  试验方法

1.2.1  菌株的活化和发酵培养  将保存的放线菌菌株CTF619-D接种于高氏1号固体培养基上，置于28 ℃生化培养箱中培养7 d，进行活化。然后将菌种接种至装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，于28℃、140 r/min培养振荡器中培养。

1.2.2  抑菌活性物质的测定  将菌株CTF619-D接种于发酵培养基中进行发酵，经不同的发酵培养条件培养后，将菌液于4 000 r/min条件下无菌离心10 min。然后把无菌滤纸片在离心所得的上清液中浸泡3 min后置于接种农业致病真菌的PDA平板中央，于25℃条件下恒温培养72h后，再分别测量抑菌圈直径，每个试验均设3个重复，取平均值。确定最佳发酵条件。

1.2.3  响应面法优化发酵试验

1）Placket-Burman（P-B）设计试验[6]。首先采用单因素试验依次对淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、种子菌龄、接种量、装液量、发酵时间、温度、摇床转速、pH等11个液体发酵工艺参数进行优化。每个试验均设3个重复，取平均值。然后对植物病原菌进行抑制试验。确定抑菌圈最大的单因素发酵培养条件。然后在单因素试验的基础上，选取N=11的P-B试验进行设计，将影响微生物发酵11个因素作为P-B设计的主要成分。根据单因素对高水平（1）和低水平（-1）进行设定，一般高水平设定为低水平的1.25～1.50倍，抑菌圈直径作为响应值y。P-B设计试验因素与水平见表1。数据采用SPSS 17.0 统计软件进行统计处理，分别对数据作单因子方差分析，以P<0.05表示差异性显著。选出影响抑菌圈大小的3个显著因子。

2）Box-Behnken（B-B）试验设计。在单因素试验及P-B试验的基础上，选取对整个发酵模型影响最大的3个显著因子进行响应面分析，利用Design-Expert 8.0.6软件进行B-B试验设计，每个因素3个水平，中心点有5个重复。响应面分析试验以显著因素为自变量，以抑菌圈直径为响应值，来确定各因素对植物病原菌影响。

1.2.4  模型的验证试验  为了进一步验证预测值，利用优化后确定的培养条件进行发酵试验，每个试验均设3个重复，取平均值。所得数值与预测值进行比较，来确定采用响应面法优化得到的发酵条件是否准确可靠，是否具有实用价值。

2  结果与分析

2.1  Placket-Burman试验结果分析

按照Placket-Burman试验的设计方法来考察各个因素对响应值抑菌圈直径的影响。P-B试验结果见表2。表中数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理（见表3），在这个模型中X7、X9、X10 3项的P值较其他项小，为模型的显著项。筛选出影响发酵培养的3个显著因子依次为装液量、温度、摇床转速。其P值均小于0.05。说明这个回归模型是具有统计学意义的。由表3回归模型方差分析表可知，回归分析的决定系数R2=1.000，说明自变量和因变量形成的散点与回归曲线高度接近，即散点基本都集中于回归线上。说明这个回归模型是具有统计学意义的。

2.2  显著影响因子的Box-Behnken试验结果分析

由表5可知，20组试验中除3个显著因素外，其他因素取值与初始培养条件中取值一致。按照试验设计的培养条件进行发酵培养，并对植物病原菌进行抑菌活性测定。每组重复3次，结果取平均值，得到相应的抑菌圈直径填入表中。利用Design-Expert8.0.6软件对表5结果进行处理，确定回归方程为Y=27.22-0.59A-1.27B-1.01C+0.38AB-0.37AC+0.38BC-1.98A2-1.98B2-2.51C2。该回归方程的方差分析结果见表6。其中模型P<0.000 1，失拟P=0.104 1>0.05。说明该模型回归显著而失拟不显著。另外，通过可信度分析可看知，精简模型校正后的复相关系数的平方为0.945 5，说明精简模型能解释响应值变化的94.55%，进一步证明试验方程式与实际数据之间具有非常好的拟合性。预测值和实际值之间具有高度的相关性。另外调整后的复相关系数为0.896 4，说明89.64%数据的可变性可用此模型来解释，即响应值的变化有89.64%取决于装液量、温度、摇床转速3个显著因子的取值，因此可以用该方法对其结果进行预测和分析，离散系数（Coeflcient of variation，CV）表示试验精确度。其值越大，试验的可靠性就越低。此模型中CV为4.88%，说明试验操作可信，模型选择正确。所以，可确定此回归方程准确、可靠。同时得出当摇床转速为119.33 r/min，装液量为109.75 mL，温度为26.78 ℃，理论抑菌圈最大直径为27.58 mm。

响应曲面图是回归方程的图形表述，通过响应面和等高线图可以直观、有效地找到最佳参数和各参数之间的相互作用及最大响应值。由以上回归方程，通过Design-Expert软件作出抑菌圈直径对装液量、温度、摇床转速的响应曲面图，最大响应值由等高线上最小椭圆所示（图1～图3）。通过计算回归方程的值可知，响应面图所示最大响应值和各因素参数值与计算的值一致。

2.3  模型的验证

为了检验响应面分析法的可靠性，采用上述优化参数进行发酵试验，实际测得抑菌圈的直径为27mm，与预测值的相对误差为2.11%（表7）。采用响应面分析法优化得到的培养条件工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3  结论

P-B设计法是近年来国际上普遍采用的试验 设计方法[7-9]，它能快速、有效地从众多因子中筛选出影响抑菌活性最为重要的几个因素供进一步研究。响应面法（RSM）是一种优化过程的综合技术，可同时对影响生物过程的因子水平及其交互作用进行优化与评价[10]。因此它可快速有效地确定多因子系统的最佳条件[11，12]。与传统优化方法相比，RSM所需的试验组数相对较少，优化方法更为有效，因此基于这种统计方法的试验设计广泛地应用于生化微生物工程等方面[13-16]。本试验利用Design-Expert 8.0.6软件对CTF619-D菌株的发酵条件进行响应面优化分析，数据采用 SPSS 17.0统计软件进行统计处理，建立多项数学模型，并利用SAS对模型进行显著性检验。优化得到最佳发酵条件为： 淀粉17.5 g/L，硝酸钾1.1 g/L，磷酸氢二钾0.4 g/L，硫酸亚铁0.001 g/L，种子菌龄72 h，接种量17 mL，发酵时间6.5 d，pH 7.5，摇床转速为119.33 r/min，装液量为109.75 mL，温度为26.78 ℃。在此优化条件下，抑菌圈直径直径为27.58 mm，较优化前的抑菌圈直径（16 mm）提高了72%，为菌株CTF619-D的发酵培养提供了理论试验数据，为进一步研究CTF619-D菌株及工业化液体发酵奠定基础。

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