玉米19,kD醇溶蛋白启动子克隆与植物表达载体构建

摘要：从玉米自交系９８０１基因组ＤＮＡ中克隆了玉米19 kD醇溶蛋白基因（ｚｅ１９）启动子，将其连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上。测序结果表明该序列与已报道序列同源性为９４％，包含ＴＡＴＡｂｏｘ、ＣＡＡＴｂｏｘ启动子基本元件以及ＧＣＮ４、ｓｋｎ－１、ｐｒｏｌａｍｉｎ ｂｏｘ、－３００ ｅｌｅｍｅｎｔ等参与调节玉米醇溶蛋白表达及活性的顺式元件。将克隆的ｚｅ１９启动子取代质粒ｐＢＩ１２１中的３５ Ｓ启动子，成功构建了由ｚｅ１９启动子驱动ｇｕｓ报告基因的植物表达载体ｐＢＩｚｅ１９。利用土壤杆菌介导法将构建好的重组质粒ｐＢＩｚｅ１９转入烟草中，为进一步研究该启动子组织特异性表达奠定了基础。

关键词：ｚｅ１９启动子；土壤杆菌介导法；植物表达载体

中图分类号：Ｑ７８５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2775-05

Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ １９ ｋＤ Ｚｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｍａｉｚｅ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ

ＬＩ Ｈｕｉ－ｌｕｎ１，２，ＷＥＩ Ｙａｎ－ｌｉ２，ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｍｅｉ２，ＨＵ Ｊｉｎ－ｄｏｎｇ２，ＬＩ Ｊｉ－ｓｈｕｎ２，ＹＡＮＧ Ｈｅ－ｔｏｎｇ２

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｚｉｂｏ ２５５０４９， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｊｉｎａｎ ２５００１４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ １９ ｋＤ ｚｅｉｎ（ｚｅ１９）ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｉｎｂｒｅｄ ｌｉｎｅ ９８０１， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ１８－Ｔ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｈａｒｅｄ ９４％ ｈｏｍｏｌｏgy ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ｔｗｏ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ， ＴＡＴＡ ｂｏｘ ａｎｄ ＣＡＡＴ ｂｏｘ， ａｎｄ ｓｅｖｅｒａｌ ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ， ｓｕｃｈ ａｓ ＧＣＮ４ ｍｏｔｉｆ， sｋｎ－１ ｍｏｔｉｆ， ｐｒｏｌａｍｉｎ ｂｏｘ，－３００ ｅｌｅｍｅｎｔ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｎｅｃｅｓｓｉｔｙ ｆｏｒ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｚｅｉｎ． Ｂｙ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ ３５ Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， ｚｅ１９ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ β－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ （ｇｕｓ） ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄ pＢＩ１２１； ａｎｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩｚｅ１９ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｖｉａ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ， ｔｈｕｓ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｂｏｕｔ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｚｅ１９ ｐｒｏｍｏｔｅｒ was laid．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｚｅ１９ ｐｒｏｍｏｔｅｒ； Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｔｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ； ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ

随着植物基因工程的不断完善，人们需要目的基因准确高效地在受体植物特定部位表达，但组成型启动子使基因表达分散而造成目标部位表达量不足，难以满足要求，因此克隆专一的组织特异性启动子成为目前植物基因工程研究的重点［１］。玉米醇溶蛋白是玉米种子贮藏蛋白的主要成分，占总蛋白的５０％～６０％。根据醇溶蛋白一级结构的相似性可分为α、β、γ、δ ４种，其中α－醇溶蛋白由２５～５０个基因组成的基因家族编码，包括１９ ｋＤ和２２ ｋＤ的醇溶蛋白。由于玉米醇溶蛋白基因的表达具有严格的时空特异性，在种子发育过程中，其表达严格限定在胚乳组织中，一般授粉后１０～１２ ｄ开始表达［２］，因此本实验从玉米基因组中克隆了１９ ｋＤ醇溶蛋白基因（ｚｅ１９）的启动子序列，对其结构和功能进行分析，以期构建种子特异性启动子，为玉米种子生物反应器的研究奠定基础。

１材料与方法

１．１材料和试剂

玉米自交系９８０１、烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ，ＷＴ）均来自山东省农业科学院高新技术中心。大肠杆菌ＴＯＰ１０、土壤杆菌ＬＢＡ４４０、植物表达载体ｐＢＩ１２１均由山东省科学院中日友好生物技术研究中心保存，克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ、各种限制性内切酶和Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购自Ｔａkａrａ公司，其他化学试剂为国产分析纯，ＰＣＲ引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

１．２启动子的ＰＣＲ扩增与克隆

以玉米自交系品种９８０１幼苗为材料，利用ＣＴＡＢ法［３］提取玉米基因组ＤＮＡ。根据Ｇｉｏｖｉｎａｚｚｏ等［４］发表的ｚｅ１９启动子序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ｘ６３６６７），设计一对特异引物Ｐ１：５′ＡＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡ

ＣＡＧＡＣＣＣＧＣＣＴＣＡ３′（划线部分为引入的Ｈｉｎ ｄ Ⅲ酶切位点）；Ｐ２：５′ＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴＴＧＧＴＡＣＡＣＴ

Ａ ３′（划线部分为引入的Ｂａｍ ＨⅠ酶切位点）。以９８０１玉米基因组ＤＮＡ为模板，扩增该基因起始密码子上游约１ ４００ ｂｐ的调控序列。ＰＣＲ体系为５０ μＬ，包括１０×Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ Ｐ１ ２ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ Ｐ２ ２ μＬ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰs １．２ μＬ，基因组ＤＮＡ模板 １ μＬ，Ｔａｑ酶 ０．５ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ３８．３ μＬ。ＰＣＲ反应程序为：９４ ℃预变性，５ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５０ ℃退火５０ ｓ，７２ ℃延伸９０ ｓ，３０个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，与克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ在Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶作用下１６ ℃保温过夜，构建重组质粒ｐＭＤ１８－ｚｅ１９。将连接反应产物转化大肠杆菌ＴＯＰ１０感受态细胞，提取质粒，经ＰＣＲ、酶切鉴定后，将阳性转化子送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并保存菌种。

１．３ｚｅ１９－ｇｕｓ融合表达载体的构建

将重组质粒ｐＭＤ１８－ｚｅ１９和ｐＢＩ１２１－ｇｕｓ分别用Ｈｉｎ ｄⅢ和Ｂａｍ ＨⅠ进行双酶切，在Ｔ４ ＤＮＡ连接酶作用下，１６ ℃连接反应过夜，连接反应产物转化大肠杆菌ＴOP１０感受态细胞，利用ＰＣＲ及酶切方法筛选阳性转化子，并进行测序鉴定，得到植物表达载体ｐＢＩ ｚｅ１９－ｇｕｓ，表达载体构建过程如图１所示。

１．４土壤杆菌介导的烟草转化

采用液氮冻融法将重组植物表达载体ｐＢＩ ｚｅ１９－ｇｕｓ转入土壤杆菌ＬＢＡ４４０４中，采用碱裂解法［５］提取重组土壤杆菌的质粒，ＰＣＲ鉴定转化子。表达载体pＢＩ １２１－ｇｕｓ中ｇｕｓ基因上游含有３５ Ｓ启动子，因此将其转入土壤杆菌，作为分析ｚｅ１９启动子活性时的阳性对照，设计ｇｕｓ部分基因（约５００ ｂｐ）的引物（Ｐ１：５′ＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＧＴＡＡＴＧ３′；Ｐ２：５′ＧＣＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣ３′）对其进行ＰＣＲ鉴定。

挑取土壤杆菌阳性重组子于含抗生素（５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ，５０ ｍｇ／Ｌ Ｓｔｒ）的２ ｍＬ ＹＥＢ液体培养基中，２８ ℃过夜培养，转接到２０ ｍＬ ＹＥＢ培养基中，２８ ℃继续培养至ＯＤ６００为０．６左右，用刀片将烟草无菌苗叶片边缘部分切去并弃中脉，切成约１ ｃｍ２大小作为土壤杆菌侵染外植体，在土壤杆菌菌液中侵染５～１０ ｍｉｎ，其间不断摇动，侵染后的外植体用无菌滤纸吸干菌液置于ＭＳ分化培养基上（２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ），２８ ℃暗培养２ ｄ，转入ＭＳ筛选分化培养基（５０ ｍｇ／Ｌ Kａｎ，２００ ｍｇ／Ｌ Ｃａｒｂ，２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ）中。２５ ℃光照培养约２周后，将烟草愈伤组织及部分抗性芽转入新鲜培养基中继代培养，待抗性芽长至２ ｃｍ左右切下转入ＭＳ生根培养基（５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ，２００ ｍｇ／Ｌ Ｃａｒｂ，０．５ ｍｇ／Ｌ ＩＡＡ）中。待根系发育良好进行室内移栽，随机选取１２株长势良好的植株提取其叶片总ＤＮＡ，ＰＣＲ和琼脂糖凝胶电泳检测其是否含有ｚｅ１９启动子，并设立阴性对照（野生型烟草基因组ＤＮＡ）、阳性对照（构建的重组质粒ｐＢＩｚｅ１９）。

２结果与分析

２．１ｚｅ１９启动子的扩增、克隆和序列分析

以玉米自交系９８０１基因组ＤＮＡ为模板，根据所设计的引物进行ＰＣＲ扩增，可特异地扩增到约

１ ４００ ｂｐ的条带（图２），与目的片段大小一致。将ｚｅ１９启动子ＰＣＲ纯化产物连接到ｐＭＤ１８－Ｔ上得到重组质粒ｐＭＤ１８－ｚｅ１９，进行Ｈｉｎ ｄⅢ和Ｂａｍ ＨⅠ双酶切鉴定，可切出大小约１ ４００ ｂｐ的条带（图３），与ｚｅ１９启动子片段大小一致，证明ｚｅ１９ ＰＣＲ产物已连接到ｐＭＤ１８－Ｔ，将重组质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

测序结果表明得到的启动子长度为１ ４２５ ｂｐ，与报道序列同源性为９４％，其３′末端紧邻该基因起始密码子ＡＵＧ，与报道序列相比缺失了２０ ｂｐ，缺失序列位于启动子的可变区，不属于保守序列，不同玉米品系之间均有差异［４］；另外整个序列有２２个碱基发生了改变，包括１２个碱基的突变和１０个碱基的插入或缺失。采用Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ启动子数据库进行功能预测，结果表明该序列存在２处核心启动子区域（表１），并且得分较高（总分为１分），初步判断此克隆序列具有启动子结构。

为了分析序列差异是否发生在启动子功能元件和重要调控区域，通过ＰＬＡＣＥ和ＰＬＡＮＴＣＡＲＥ数据库对启动子进行顺式调控元件分析。发现该序列含有ＴＡＴＡ ｂｏｘ和ＣＡＡＴ ｂｏｘ启动子核心元件，属于典型启动子。该启动子序列中还具有胚乳表达特异性元件，如ＧＣＮ４、ｓｋｎ－１、ｐｒｏｌａｍｉｎ ｂｏｘ、－３００ ｅｌｅｍｅｎｔ等参与调节玉米醇溶蛋白表达及活性的顺式元件（表２）。序列分析结果表明，在ＴＡＴＡ ｂｏｘ和ＣＡＡＴ ｂｏｘ以及ｚｅ１９启动子调节基因特异表达的调控区域没有发生碱基的变化。此外，该序列中还发现了调节植物生长发育的一些应激元件，例如光反应元件Ｉ－ｂｏｘ、ＣＡＴＴ－ｍｏｔｉｆ、ＧＴ１－ｍｏｔｉｆ、Ｓｐ１、ＧＡ－ｍｏｔｉｆ、Ｇ－ｂｏｘ、ＧＡＴＡ－ｍｏｔｉｆ、ＧＡＧ－ｍｏｔｉｆ；抗氧化元件ＡＲＥ；抗逆反应顺式作用元件ＭＢＳ、ＬＴＲ；代谢调控元件Ｏ２－ｓｉｔｅ等顺式元件，这些元件可能在植物的生长发育和器官发育中起重要作用。

２．２含ｚｅ１９启动子的植物表达载体

构建的植物表达载体ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ经ＰＣＲ扩增得到片段大小约为１ ４００ ｂｐ的产物（图４），通过

Ｈｉｎ ｄⅢ与Ｂａｍ ＨⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测，也得到大小约为１ ４００ ｂｐ的启动子片段（图５），与预期结果相符。表明ｚｅ１９启动子已插入到表达载体ｐＢＩ１２１中，测序结果也显示重组表达载体ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ已构建成功。

将重组载体ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ与阳性对照质粒ｐＢＩ１２１－ｇｕｓ通过冻融法转化土壤杆菌，ＰＣＲ鉴定转化子。结果表明，在转ｐＢＩｚｅ１９重组质粒的土壤杆菌中扩增到了约１ ４００ ｂｐ的片段（图６），说明ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ已经成功转化土壤杆菌；而在转ｐＢＩ１２１－ｇｕｓ质粒的土壤杆菌中扩增到了约５００ ｂｐ的ｇｕｓ片段（图７），表明ｐＢＩ１２１也已经成功转化土壤杆菌。

２．３转基因烟草的获得

烟草叶盘经土壤杆菌侵染１周后，外殖体迅速生长，周围已经开始形成愈伤组织；而没有经土壤杆菌侵染的阴性对照，在含相同浓度卡那霉素的筛选培养基上叶盘没有长大，叶盘周围也没有愈伤组织形成（图８）。

连续继代培养４～５周以后，外殖体分化出大量的愈伤组织及抗性芽（图９），结果表明，筛选分化培养基中抗生素和生长素的浓度及其配比可以满足烟草叶盘选择分化的需要。将抗性芽转入生根培养基中，一个月后根系发达（图１0），可以进行室内移栽。

随机选取１２株生长良好的植株提取其叶片总ＤＮＡ，以基因组为模板利用ｚｅ１９启动子的特异引物进行ＰＣＲ扩增，经检测１２株转ｐＢＩｚｅ１９－ｇｕｓ的烟草抗性苗有１０株是阳性植株，转化率达到８３％，而阴性对照没有扩增到条带（图１1）。

３讨论

玉米醇溶蛋白的表达具有严格的组织特异性，被严格限定在种子胚乳中，是研究组织特异性启动子的良好材料。根据１９ ｋＤ玉米醇溶蛋白启动子保守序列，设计特异引物从玉米９８０１自交系中扩增启动子片段，扩增到长约１ ４００ ｂｐ的片段。将该片段连接克隆载体并测序后，该序列与报道序列同源性为９４％。通过生物信息学方法对该序列进行序列分析和功能预测，该序列具有两处核心启动子区域，一个位于转录起始位点上游－４９ ｂｐ位置，另一个位于－１ １８９ ｂｐ位置，区域得分分别为０．９２、０．９３，这与Ｇｉｏｖｉｎａｚｚｏ等［４］的报道一致。在序列结构上，克隆序列含有ＧＣＮ４、Ｓｋｎ－１、Ｐｒｏｌａｍｉｎ ｂｏｘ、－３００ ｅｌｅｍｅｎｔ等多个种子或胚乳表达特异性调控元件。因此，在理论上，所克隆启动子序列具有种子特异性启动子的潜在功能。

实验选用pＢＩ１２１质粒作为基本载体，用ｚｅ１９置换表达载体ｐＢＩ１２１中的３５ Ｓ启动子，构建植物表达载体ｐＢＩｚｅ１９，因为质粒ｐＢＩ１２１的３５ Ｓ启动子下游连接报告基因ｇｕｓ，ｇｕｓ基因在很多植物中没有内源活性，并且其检测方法灵敏、快速、稳定、线性好，方便下一步对启动子表达情况的研究。构建好的表达载体ｐＢＩｚｅ１９可以用于下一步植物转化和再生，研究启动子活性，也可以用于其他转基因植物研究。

玉米醇溶蛋白基因启动子在外源植物中的表达调控是个很复杂的问题，还需要利用克隆的玉米１９ ｋＤ醇溶蛋白基因启动子对其表达部位、表达周期以及表达强度进行研究。相对于组成型启动子而言，种子贮藏蛋白基因启动子具有很强的组织和发育特异性［１１］，可避免外源基因在转基因宿主植株中非特异表达所造成的能量负荷和物质浪费［１２］。因此，利用种子特异性的启动子来启动外源基因以保证外源基因的高效表达，可用于改良农作物品种和性状以提高产品质量，目前人们已经开始利用转基因植物作为新型的生物反应器（Ｂｉｏｒｅａｔｏｒ）来生产有意义的次生代谢物、蛋白质、糖类和脂类等［１３］。

参考文献：

［１］ 王昌涛，梁粤，王欢，等． 玉米Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ启动子的克隆及功能鉴定［Ｊ］． 沈阳农业大学学报，２００６，３７（１）：９－１２．

［２］ 梁华，马崇烈，赵倩，等． 玉米１９ＫＤ醇溶蛋白基因启动子的克隆及活性分析［Ｊ］． 生物工程学报，１９９６，１２（３）：２９５－３００．

［３］ 闫新甫． 转基因植物［Ｍ］． 北京：科学出版社， ２００３． １５６－１５８．

［４］ ＧＩＯＶＩＮＡＺＺＯ Ｇ， ＭＡＮＺＯＣＣＨＩ Ｌ Ａ， ＢＩＡＮＣＨＩ Ｍ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ａ ｚｅｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２， １９（２）： ２５７－２６３．

［５］ ＳＡＭＢＲＯＯＫ Ｊ，ＦＲＩＴＳＣＨ Ｅ Ｆ，ＭＡＮＩＡＴＩＳ Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ［Ｍ］． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９．

［６］ ＴＡＫＡＩＷＡ Ｆ，ＯＯＮＯ Ｋ，ＷＩＮＧ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍａｊｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｌｕｔｅｌｉｎ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９１，１７（４）：８７５－８８５．

［７］ ＣＨＥＮＧ Ｓ， ＷＡＮＧ Ｚ，ＨＯＮＧ Ｍ． Ｒｉｃｅ ｂＺＩＰ ｐｒｏｔｅｉｎ， ＲＥＢ， ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＧＣＮ４ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆＷａｘｙ ｇｅｎｅ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ Ｃ： Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００２，４５（４）：３５２－３６０．

［８］ ＴＨＯＭＰＳＯＮ Ｇ Ａ， ＬＡＲＫＩＮＳ Ｂ Ａ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｚｅｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］． ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１９８９，１０（４）：１０８－１１３．

［９］ ＱＵＡＹＬＥ Ｔ， ＦＥＩＸ Ｇ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ－３００ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｚｅｉｎ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ， １９９２， ２３１（３）：３６９－３７４．

［１０］ ＵＥＤＡ Ｔ， ＷＡＮＧ Ｚ， ＰＨＡＭ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ２７－ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｚｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ， ｔｈｅ －３００ ｅｌｅｍｅｎｔ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４，１４（７）：４３５０－４３５９．

［１１］ 魏琦超，周蕾，杨贤松，等． 种子贮藏蛋白的基因启动子及其应用研究概述［Ｊ］．河南农业科学，２００５（１２）：１０－１３．

［１２］ 马三梅，王永飞． 种子特异性启动子的研究进展［Ｊ］．种子，２００７，

２６（１）：５０－５３．

［１３］ 范三红，金伟波，郭蔼光，等． 小麦高分子量谷蛋白１Ｄｘ２基因启动子的克隆及功能鉴定［Ｊ］． 西北农林科技大学学报，２００５， ３３（５）：９５－９９．

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

推荐访问： 克隆 载体 蛋白 玉米 构建