[摘要] 目的：筛选适用于分离纯化黄连小檗碱的大孔吸附树脂。方法：本文考察了10种大孔吸附树脂，筛选出了适用于分离纯化黄连小檗碱的D101大孔吸附树脂，其静态吸附量为18.08 mg/g，静态和动态解吸率均为95%以上。结果：选用D101大孔吸附树脂，先水洗除杂，再用4～5倍树脂体积的60%乙醇洗脱，浓缩干燥，产品中小檗碱的含量为30.02%，产品收率为9.12%。结论：本法简单、易行，适合黄连小檗碱的提取。
[关键词] 黄连 小檗碱 分离 纯化
[中图分类号] R284.2[文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）02（b）-044-03
Study on separation and purification of berberine in Coptis chinensis by macroporous adsorption resin
XI Guoping, SONG Guobin
(The Medical College of Datong University, Shanxi Province, Datong 037009, China)
[Abstract] Objective: To study on separation and purification of berberine in Coptis chinensis by macroporous adsorption resin. Methods: From the 10 kinds of different macroporous adsorption resins, the D101 resin which the adsorption performance was 18.08 mg/g and the desorption ratio was over 95% was selected to separate the berberine in Coptis chinensis. Results: The desorption ratio of over 95% could be gotten by using 60% ethanol as eluting solvent and 4-5 BV. Under these experiment conditions, the content of berberine in products was 30.02% and the yield was 9.12%. Conclusion: The method is easy, possessed of popularization and application value. It can be used for separation berberine from Coptis chinensis.
[Key words] Coptis chinensis; Berberine; Separation; Purification
黄连为毛茛科多年生草本植物，主要分布于川、黔、滇、鄂等省高寒阴暗潮湿的局部山区，为我国西南部著名的中药材[1]。黄连根茎主要含有小檗碱，其次为黄连碱、甲基黄连碱、药根碱等，由于结构相似，统称为黄连生物碱[2]。小檗碱有明显抗心律失常、降血糖、抗肿瘤等重要作用[3]。本文采用孔径、极性等有显著性差异，广泛应用于中草药化学成分分离与富集[4]，选择吸附性较好的大孔吸附树脂对黄连小檗碱进行分离纯化研究。
1 仪器与试药
黄连，购于贵阳市花溪区中西药结合第四药店，经鉴定为毛茛科植物黄连；盐酸小檗碱标准品，中国药品生物制品检定所；大孔吸附树脂，天津南开大学化工厂；FA1004电子天平，青岛扬中仪器有限公司；UNICO UV-2000型紫外-可见分光光度计，上海肯强仪器有限公司；RE-200型旋转蒸发仪，上海科兴仪器有限公司；KS康氏振荡器，上海圣科仪器设备有限公司；LGJ-10 冷冻干燥机，河南兄弟仪器设备有限公司。
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 黄连的前处理
将黄连放入50℃烘箱中烘烤变脆，粉碎，放入冰箱保存。
2.1.2 黄连小檗碱浸出液的制备
称取适量处理好的黄连，用9倍体积60%乙醇（W/V），60℃回流提取2次，每次提取1 h，合并提取液，50℃减压浓缩，备用。
2.1.3 大孔吸附树脂柱层析
2.1.3.1 树脂的预处理树脂先用蒸馏水浸泡24 h，充分溶胀，滤去浮在表面的树脂颗粒，然后用4 mol/L的NaOH浸泡12 h，用蒸馏水洗至中性；再用4 mol/L的HCl浸泡12 h，用蒸馏水洗至中性；最后用乙醇浸泡6 h，再用水洗至无醇味，备用。
2.1.3.2层析分离纯化将浸出液用60%乙醇配制成浓度约为3.5 mg/ml的黄连小檗碱提取液，过滤，上样，洗脱，收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥得产品。
2.1.4 黄连小檗碱测定方法
采用分光光度法，以盐酸小檗碱为标准品，准确配制3、6、9、12、15、18 μg/ml标准溶液，于345 nm波长处测定吸光度，由最小二乘法得浓度与吸光度标准曲线方程，并根据此方程计算黄连小檗碱含量[5-6]。
2.2 结果
2.2.1 标准曲线方程
根据“2.1.2”结果，用最小二乘法作线性回归，得盐酸小檗碱浓度C（μg/ml）与吸光度A的关系：A=0.05 491C-0.031 42（r=0.999 9）。
2.2.2 树脂吸附量的测定
称取不同型号树脂10份（已处理），每份5 g，置于具塞三角瓶中，各加入30 ml浓度为3.44 mg/ml的黄连小檗碱提取液，振荡20 h，振荡频率为240次/min。振荡后，滤过，测定滤液中黄连小檗碱浓度，计算各树脂吸附量（mg/g），结果见表1。
式中Q为吸附量，C0为起始浓度，CR 为剩余浓度，V为溶液体积，W 为树脂重量。
表 1 不同树脂对黄连小檗碱的吸附量
Tab.1 Berberine absorption performance of different resins
从表1可见，在设定实验条件下， D101、X-5、NKA-2、H103大孔吸附树脂对黄连小檗碱的吸附量较高。
2.2.3 解吸率的测定
选择“2.2.2”筛选出的4种树脂，每种树脂称取4份，每份5 g，按照“2.2.2”方法吸附，滤过，风干，在滤出树脂中分别加入30 ml浓度为30%、50%、70%、90%的乙醇，按“2.2.2”振荡条件，振荡10 h，过滤，测定滤液中黄连小檗碱浓度，计算解吸率（%）。结果见图1。
图 1 不同解吸剂对小檗碱解吸率
Fig.1Desorption ratio of berberine under different eluting solvent
结果表明，D101大孔吸附树脂的解吸率最高，70%乙醇在所考察溶剂中对黄连小檗碱解吸能力最强。
2.2.4 不同洗脱剂的洗脱结果
称取D101大孔吸附树脂9份（已处理），每份30 g，分别装柱，量取30 ml浓度为3.52 mg/ml的黄连小檗碱提取液，上样，分别用浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇洗脱，流速为2 ml/min，至流出液无色，收集洗脱液，浓缩，60%乙醇定容至50 ml，测定黄连小檗碱含量。见图2。
图 2 不同浓度乙醇的洗脱能力
Fig.2 Elution capacity of different concentrations of ethanol
结果表明，60%乙醇对黄连小檗碱洗脱率最高。
综合“2.2.3”和“2.2.4”实验结果：D101大孔吸附树脂静态吸附量为18.08 mg/g，静态及动态解吸率均为95%以上，为所考察树脂中最好的。
2.2.5 树脂吸附-解吸影响因素
2.2.5.1 pH的影响称取D101大孔吸附树脂5份（已处理），每份5 g，于具塞三角瓶中，各加入30 ml浓度为3.42 mg/ml的黄连小檗碱提取液，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl溶液将各提取液分别调至设定的pH值，按“2.2.2”振荡条件，振荡20 h，滤过，测定滤液中黄连小檗碱浓度，计算吸附量（mg/g）。见图3。
图 3 pH值对吸附的影响
Fig.3 Effect of pH on adsorption
结果表明，D101大孔吸附树脂在酸性环境下对黄连小檗碱的吸附量优于碱性环境。
2.2.5.2 温度对吸附的影响称取D101大孔吸附树脂5份（已处理），每份5 g，于具塞三角瓶中，各加入30 ml浓度为3.46 mg /ml的黄连小檗碱提取液，分别在设定温度下水浴加热，按“2.2.2”振荡条件，每隔10 min振荡30 s，加热时间为2 h。加热后，过滤，60%乙醇定容至50 ml，测定黄连小檗碱浓度。见图4。结果表明，在室温下，树脂的吸附量最高。
2.2.5.3 洗脱剂用量的影响称取D101大孔吸附树脂（已处理）30 g，装柱，量取30 ml浓度为3.55 mg/ml的黄连小檗碱提取液，上样，60%乙醇洗脱，流速为2 ml/min，收集洗脱液，浓缩，测定黄连小檗碱含量。见图5。
图 5 不同洗脱剂用量的洗脱率
Fig.5 Effect of quantity of different eluting solvent on the desorption ratio
结果表明，4倍树脂体积洗脱剂用量时，解吸率已达到95.25％，继续增加洗脱剂用量，洗脱率没有显著增加。
2.2.5.4 洗脱速度的影响称取D101大孔吸附树脂5份（已处理），每份30 g，分别装柱，量取30 ml浓度为3.57 mg/ml的黄连小檗碱提取液，上样，60%乙醇分别以设定流速洗脱，至流出液无色，收集洗脱液，浓缩，测定黄连小檗碱的含量。见图6。结果表明，洗脱率最高时，洗脱速度为2 ml/min。
2.2.5.5 分离纯化后的产品量取100 ml浓度为3.43 mg/ml的黄连小檗碱提取液，上D101大孔吸附树脂柱，依次用水、60％乙醇洗脱，后者用量为4～5倍树脂体积，浓缩洗脱液至干，冷冻干燥后，得产品，结果见表2。
表 2 分离纯化后的产品数据
Tab.2 Data of purified product
3 结论
本文从树脂选用、影响树脂分离纯化的因素出发，对大孔吸附树脂分离纯化黄连小檗碱进行了探讨。实验表明，D101大孔吸附树脂作为分离纯化树脂，先水洗除杂，再用4～5倍树脂体积的60%乙醇洗脱，浓缩洗脱液，冷冻干燥后的产品中黄连小檗碱的含量为30.02%，收率为9.12%。
[参考文献]
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[3]田智勇,李振国.黄连的研究新进展[J].时珍国医国药,2004,15(10):704-706.
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[6]魏英勤,房海燕,袁久荣.影响大孔树脂吸附黄连提取液的因素[J].中国药业,2003,(2):44.
（收稿日期：2010-09-20）
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