透明颤菌血红蛋白基因在多粘芽孢杆菌中的克隆和表达

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 多粘芽孢杆菌NR1为实验室自行筛选，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168为实验室保存，Escherich coli Top10购自上海生物工程股份有限公司，质粒pMD18T、pCM20、pMD18T-vgb为实验室保存。

1.1.2 工具酶及试剂 限制性内切酶、连接酶及Taq酶均购自TaKaRa公司。抗生素及其他生化试剂均购自上海生物工程股份有限公司。

1.1.3 培养基 种子培养基（LB培养基1 L，pH 7.0）：10 g NaCl、10 g蛋白胨、0.5 g 酵母浸粉。发酵培养基（1 L，pH 7.0）：30 g淀粉、15 g葡萄糖、8 g （NH4）2SO4、1 g NaCl、1 g KH2PO4、0.2 g MgSO4、3 g CaCO3、3%玉米浆30 mL。

1.2 方法

1.2.1 引物和测序 引物合成和测序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2.2 提取、酶切、连接和转化 芽孢杆菌总DNA的提取、大肠杆菌感受态细胞的制备，质粒的提取、酶切、连接和转化均参照文献[9-11]。

1.2.3 P43启动子与vgb基因的克隆和融合 以枯草芽孢杆菌168的总DNA为模板，用引物BP43F/R扩增枯草芽孢杆菌P43启动子，上游引物BP43F引入EcoR V酶切位点；以质粒pMD18T-vgb为模板，用引物vgbF/R扩增得到vgb基因，下游引物vgbR也引入EcoR V酶切位点。再以上述两个片段为模板，用引物BP43F和vgbR将P43启动子片段和vgb基因片段进行重叠PCR得到融合片段。

1.2.4 多粘芽孢杆菌的转化 将上述方法得到的融合片段插入pCM20的EcoR V位点中，经过筛选得到重组子。将重组载体pCM-vgb电转化多粘芽孢杆菌，在红霉素平板上挑取多个菌落，通过PCR鉴定，挑选多个阳性菌落进行下一步的发酵研究。

1.2.5 生长曲线的测定 为检测带有vgb基因重组载体的导入对宿主多粘芽孢杆菌生长情况的影响，将单独导入pCM20的对照菌株和转化了pCM20-vgb的重组菌株用LB培养基培养过夜，然后以1%的量转接至LB新鲜培养基中，37 ℃振荡培养，每隔2 h取样测定菌体OD600，绘制生长曲线。

1.2.6 发酵效价的测定 按照《中国药典》2010版（CP2010）抗生素微生物检定法（附录XIA），质量检测按照《中国药典》2010版的规定。发酵液经12 000 r/min离心10 min，取上清液，以双碟扩散法测定发酵效价，指示菌为大肠埃希氏菌。

2 结果与分析

2.1 vgb基因表达质粒的构建

用试剂盒提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，使用引物BP43F/R扩增枯草芽孢杆菌P43启动子，得到长为0.42 kb的片段，同时以质粒pMD18T-vgb为模板，用引物vgbF/R扩增得到长为0.44 kb的vgb基因片段，以上述两个片段为模板，使用重叠PCR技术得到一个同时含有两个基因的融合片段，采用酶切酶连的方式构建至pCM20载体上pCM20-vgb，经筛选鉴定后得到重组质粒pCM20-vgb（图1）。

2.2 血红蛋白表达分析

透明颤菌血红蛋白分子量大小为16 kD。SDS-PAGE分析结果表明，重组菌株发酵48 h后的菌体蛋白比原始菌株在16 kD处新增加了一条蛋白带，与预期相符合。进而用Western Blot进一步验证该重组菌株中透明颤菌血红蛋白基因的表达，结果（图2）证实了SDS-PAGE的结论。

2.3 VHb的表达对重组菌株生长发酵的影响

分别在正常供氧和贫氧两种条件下测定了重组菌株和原始菌株的生长曲线（图3），在正常供氧情况下显示在发酵的前半阶段（24 h以前），两者的生长速率、生物量积累速率基本一致。原始菌株从30 h后就快速进入稳定期，36 h左右菌体密度达到最大值，40 h后菌体开始大量降解，48 h左右全部形成了芽孢。作为对比，重组菌株大概在40 h左右进入稳定期，44 h左右菌体密度达到最大值，48 h后菌体开始大量降解，54 h左右全部形成芽孢。通过计数，虽然重组菌株的发酵周期要长一些，但是其芽孢形成数与原始菌株相当，都在6亿/mL左右，表明了该基因的表达对于芽孢形成的改善作用不大。与此对应的是在贫氧条件下，原始菌株较快进入稳定期，18 h左右即进入稳定期，24 h菌体密度达到最大，35 h时开始大量降解；重组菌株在此条件下表现稍好一些，在22 h进入稳定期，28 h密度达到最大，38 h时开始大量降解。由此可见，该菌可以在缺氧条件下有效延迟和延长其稳定生长期，这对于今后将该菌株用于发酵具有重要的意义。

2.4 VHb的表达对于重组菌株多粘菌素产量的影响

将重组菌株和原始菌株分别在正常供氧和贫氧条件下摇瓶培养一段时间后，测定多粘菌素的产量。结果（图4）显示，无论是在正常供氧还是贫氧条件下，多粘菌素的产量都得到了提高。在正常供氧条件下，重组菌株产量比原始菌株提高了24.9%；在贫氧条件下重组菌株产量比原始菌株提高了31.0%。

3 小结与讨论

VHb蛋白已被证明了能在多种宿主中进行表达且能显著提高相关代谢产物的产量。本研究成功构建了含有vgb基因的表达载体，并将其电击转化多粘芽孢杆菌NR1中实现了VHb的表达。VHb的表达明显提高了多粘芽孢杆菌在低溶氧发酵条件下的生物量，同时也提高了多粘菌素的产量。因此，vgb基因的表达成为解决供氧限制的一种新方法。该基因的应用可以降低氧气及能量的消耗，亦不需增加额外的设备投资，却可大大降低发酵的成本。综上所述，vgb基因的发现和研究为利用分子生物学技术解决微生物发酵问题提供了良好途径。

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