黄鳝出血病三联微胶囊口服疫苗制备及免疫效果研究

摘要：【目的】制备出能有效防御黄鳝出血病的三联微胶囊口服疫苗，促进黄鳝养殖业健康发展。【方法】以嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌及温和气单胞菌为抗原，海藻酸钠为壁材，利用乳化法制备三联微胶囊口服疫苗，然后直接拌入饵料对健康黄鳝进行口服免疫，7 d后进行加强免疫，测定各项血清免疫指标。加强免疫结束15 d后，经腹腔注射3种活菌（1.0×109 CFU/mL）进行攻毒试验，检验三联微胶囊口服疫苗对黄鳝的免疫保护率。【结果】制备获得的三联微胶囊口服疫苗的平均粒径为44.5 μm，平均含菌量为4.56×109 CFU/mg。按0.4和0.6 g/kg的剂量口服免疫黄鳝，其血清补体C3含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、酸性磷酸酶（ACP）活性均显著高于对照组（P<0.05），血清平均抗体效价分别为7.5949和11.0651，对应的免疫保护率为60%和65%，且0.6 g/kg剂量组的各项指标均高于0.4 g/kg剂量组。【结论】制备获得的三联微胶囊口服疫苗能显著提高黄鳝血清SOD、ACP活性及刺激血清补体C3产生，有效抵御由嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌引起的出血病，生产使用时须进行加强免疫，并适当加大免疫剂量。

关键词： 黄鳝；出血病；三联微胶囊口服疫苗；补体C3；超氧化物歧化酶；酸性磷酸酶；抗体效价；免疫保护率

中图分类号： S966.4 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-1039-06

0 引言

【研究意义】黄鳝（Monopterus albus）不仅有丰富的营养价值，还具有重要的药用价值。近年来，由于养殖密度加大、集约化程度加快及疾病研究的滞后，黄鳝病害日趋严重。黄鳝出血病是导致其死亡的主要疾病之一，具有发病快、传染性强、死亡率高等特点，如处理不及时通常会造成大批量死亡（陈怀青和陆承平，1991），但至今尚无有效的治疗方法，仍以预防为主。长期使用化学药物和抗生素进行鱼病防治极易造成药物残留、水域污染及致使部分病原产生耐药性等不良情况（殷睿，2005），与之相比，疫苗既可以提高鱼类机体的抗病能力，又不会造成环境污染和药物残留（黄宁和李海峰，2003）。多联口服疫苗是将两种及以上的疫苗同次使用或混合使用进行免疫，可预防由不同病原引起的多种疾病，或不同种病原引起的同一种疾病（李亚南等，1995；许宗丽等，2014），极大降低工人的劳动强度且操作方便，因此在实际生产中具有极高的应用价值。【前人研究进展】目前，已有较多关于黄鳝出血病的研究报道。陈怀青和陆承平（1991）从江苏某养殖场患出血病黄鳝的体内分离出嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），且首次证实嗜水气单胞菌是黄鳝出血性败血症的病原菌；马有智和舒妙安（2000）从患出血病黄鳝苗种中分离出产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）；沈锦玉等（2001）从浙江湖州某养殖场患出血病黄鳝的肝脏、肾脏中分离到致病菌，并证实该致病菌为嗜水气单胞菌；徐海圣和舒妙安（2003）从患出血病黄鳝体内分离出温和气单胞菌（Aeromonas sobria），经过人工回感试验，确定为黄鳝出血病的致病菌。在黄鳝疫病疫苗方面，仅徐海圣和舒妙安（2003）研制出黄鳝温和气单胞菌灭活疫苗，陈晓利和舒妙安（2013）制备出嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的二联疫苗。【本研究切入点】现有文献鲜见弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）能引起黄鳝出血病的报道，将黄鳝出血病的3种致病菌（温和气单胞菌、嗜水气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌）制成全菌灭活三联微胶囊口服疫苗的研究也尚未见报道。【拟解决的关键问题】将黄鳝出血病的3种病原菌制成三联微胶囊口服疫苗，并对健康黄鳝进行免疫，探究黄鳝对此疫苗的免疫应答，以期有效防御黄鳝出血病，促进黄鳝养殖业健康发展。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

2015年7月3日从河南购入健康黄鳝苗种，体重30～50 g，体长30～45 cm。黄鳝苗在余干县瑞洪镇黄鳝养殖基地人工网箱养殖30 d，选择9个等重量的网箱进行试验，网箱投放密度2.5 kg/m2。海藻酸钠、植物油、氯化钙、吐温-80均为国产分析纯，超氧化物歧化酶（SOD）活性、酸性磷酸酶（ACP）活性检测试剂盒购自南京建成生物技术研究所。主要仪器设备有振荡培养箱、生化培养箱、紫外可见光分光光度计、pH计、双目生物显微镜、电动恒速搅拌机、冷冻干燥机、冰箱等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 菌株来源及培养条件 3株病原菌分别是从患出血病黄鳝体内分离获得的嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌（杨宗英等，2015）及从中国科学院水生生物研究所购买的温和气单胞菌。将3株菌株分别接种于LB液体培养基中，28 ℃摇床培养24 h，一部分菌液用生理盐水调节至1.0×109 CFU/mL备用；一部分加入0.2%福尔马林灭活24 h，再用灭菌生理盐水离心（1500 r/min，10 min）洗涤3次，最后加入少量生理盐水用于制备微胶囊口服疫苗。

1. 2. 2 微胶囊疫苗制备 采用乳化法（Rodrigues et al.，2006）将等体积的3种菌液（共10 mL）加入到80 mL海藻酸钠溶液中，充分混合后加入乳化剂吐温-80，漩涡振荡器充分振荡至完全乳化，加入氯化钙溶液，用搅拌器充分搅拌至钙化形成均匀微胶囊，收集制得的微胶囊在冷冻干燥机中干燥过夜，制成三联微胶囊口服疫苗成品，4 ℃保存备用。

1. 2. 3 微胶囊疫苗检测 用显微镜观察三联微胶囊口服疫苗的形态并进行粒径测量。在清晰的视野中，随机选取50个微胶囊颗粒测量其直徑，取平均值；取0.10 g三联微胶囊口服疫苗溶于10 mL灭菌生理盐水中，按0.2 mL/尾的剂量对10尾外观健康的黄鳝进行腹腔注射，连续观察记录2周内的死亡情况。同时，准确称取制备的三联微胶囊口服疫苗0.01 g溶于100 mL经滤膜过滤除去死菌体的无颗粒水中，充分溶解后取1 mL进行10倍梯度稀释，取合适稀释度的试管以吖啶橙荧光直接镜检计数（徐怀恕等，1999），测定三联微胶囊口服疫苗含菌量。

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