家畜钩端螺旋体病的诊断方法

摘要：钩端螺旋体病是一种由致病性钩端螺旋体（简称钩体）所引起的一种急性人畜共患、自然疫源性传染病。致病性钩体具有多种血清群，群下又有多种血清型，由于菌型、株的不同，其对各种家畜的致病力的强弱有很大区别，因此对家畜所引起的临床症状也有不同。近年来，我国对该病的诊断取得了重大成绩，为控制该病提供了有利条件。

关键词：家畜；钩端螺旋体病；镜检；培养；诊断

中图分类号：S858.2 文献标识码：B 文章编号：2095-9737（2017）09-0076-01

1细菌学诊断

1.1直接镜检

静脉采血3～5 mL，加入抗凝剂，或吸取中段尿液5～10 mL，以1500 r/min离心5 min，取血浆和尿上清液，再分别以3000～4000 r/min离心沉淀1～2 h，然后取沉淀物检验。将肝、肾组织制成1：5或1：10悬液，1500 r/min离心5 min，取上清液，再以3000 r/min离心30 min，以沉淀物制片检验。

1.2染色镜检

姬姆萨染色法：镜检所见的钩体呈红色或紫色。

方登纳氏镀银染色法：本法操作简单方便，在油镜下背景为黄色，菌体为黑色，弯曲的长梭形，长短与红细胞直径相似；有时见到短粗枝状菌体，发病初期的肾压片，常出现两端或一端常钩的或笔直的菌体，其一端尖，另一端略圆。

免疫过氧化酶染色法：这是近年来国外提出的一种较新的酶染色法，此法是用过氧化酶标记抗体与待检标本结合后再滴加联苯胺试剂，阳性标本钩体即着色，染色的标本可长期保存。比镀银法法简单，使用普通显微镜即可检查着色钩体，是一种有前途的检查钩体的方法。

1.3分离培养

无菌采集刚发病而且伴有发热（未经药物治疗）的家畜血液接种培养基；或以病后6天以上的患畜新鲜的中段尿（或尿液经3000 r/min离心30 min后的沉淀物），接種于培养基内。如做脏器（肝、肾）培养应采集死亡动物或产后2～3 h以内的胎儿和死胎的病料。对培养在28～30℃温箱内的材料，每5天做1次悬滴压片，在暗视野显微镜下观察每管材料的生长情况。钩体通常在7～20天内开始生长，有时需要30～60天，甚至90天方能出现。

1.4动物接种

试验动物：以14～18日龄的仔兔（体重250～400 g）、幼龄豚鼠（100～200 g）、20～25日龄的犬和金黄仓鼠，对钩体的敏感性较高。接种前应测量2～3天体温及体重，并做记录，体温在正常范围者可用于接种。

接种材料：以患畜的血液、尿或死亡动物的脏器（肝、肾）悬液，对试验动物腹腔内接种，豚鼠、仓鼠均为每只1～3 mL，仔兔或幼犬均为3～5 mL。尿液5～10 mL可直接或用离心后的沉渣进行腹部皮下接种。

观察：试验动物接种后每日测温和称量体重，第一周内可隔日采心血培养1次，经过14天，动物仍然不发病，应先采心血做凝溶试验，宰杀取其肝肾组织，分别培养。如果被检血清凝溶试验阳性反应，可用同种动物盲目通过三代。

2血清学试验

2.1凝集溶解试验

阳性标准问题：目前在兽医界对凝溶的阳性判断标准尚未统一，据了解，各地判断标准不一致，有50×，100×，200×，400×，1000×，甚至有1600×判断为阳性，由于标准不同，可直接影响检出率和感染率的准确性。为提高其准确性，最好检查双份血清，第一次血样在发病后1周采集，第二次间隔7～14天左右；如第二次病畜血清抗体效价升高4倍以上，即可确诊。

交叉反应：凝溶试验虽具有特异性，但常出现较为广泛的交叉反应：原因之一，可能是抗原性接近的菌型间有一定程度的交叉，如犬热群感染时，除出现本菌群抗体外，也可出现黄疸出血、制热等群体的抗体，其消长规律虽基本一致，但在试验中对抗体效价较高的，一般可判定为感染菌型，相差较悬殊的低效价者，可认为交叉反应，后者也可用凝集吸附法进行鉴别。

影响凝溶试验的因素：抗原悬液的质量对凝溶试验的效价有直接的影响，采用老龄和高浓度培养物作抗原，所得效价较低，因此必须选用生长良好且未发育未发生畸形的较嫩钩体培养物作抗原，浓度不宜过高。在试验中常见有非特异性凝集作用和“假”凝集等现象，前者可能是菌株中次要的凝集原因子所引起。后者，由于整体在培养过程中形成星状凝集团，或因培养基中的血清颗粒将钩体黏着所致。这种现象应及时排除，以保证血清学的诊断结果。

2.2补体结合试验

微量补体结合试验，具有属的特异性，缺乏型特异性，所用的抗原为多型菌株的混合抗原，因此常用于流行病学调查，其阳性判断标准为1：20，这种方法仍存在不少问题，主要是操作复杂，多价抗原对特异性有一定程度的影响。

2.3肉眼平板凝集试验

此法简易快速诊断方法，国内正在研制中，有单位已经用于发病地。其原理是以高浓度浓缩的致病性钩体为抗原，直接与病猪血清中的钩体抗体发生特异性凝集。

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