体外MTT法对灵芝酸抗人乳腺癌细胞株MCF—7作用的评估

摘要：目的 初步探讨灵芝酸对乳腺癌的抗肿瘤作用。方法 用不同浓度（μg/ml）的灵芝酸溶液分别与MCF-7细胞共育24、48、72h后进行形态学观察，同时MTT法测定灵芝酸的细胞毒作用。结果 在100μg/ml时共育72h后，对MCF-7细胞的生长具有显著抑制作用（P<0.01）。在200μg/ml时共育24h后，对MCF-7细胞的生长具有明显抑制作用（P<0.05），72h后抑制作用更为显著（P<0.01）。随药物浓度增加，对MCF-7的作用呈增长趋势，形态学观察，在400μg/ml和800μg/ml对MCF-7细胞以毒杀作用为主。结论 灵芝酸对乳腺癌细胞有明显抗肿瘤作用，且机制复杂。

关键词：灵芝酸；乳腺癌细胞；MTT

灵芝Ganoderma lucidum （Curtis： Fr.） P. Karst.在真菌分类上属于担子菌门 （Basidiomycota），灵芝科（Ganodermataceae），灵芝属（Ganoderma p，karst），在国内有20余种，包括赤芝、黄芝、紫芝、黑芝、薄盖灵芝及树舌等，多分布于云、贵、冀、吉、浙、闽等省。现已从灵芝中分离得到多糖类、灵芝酸类、核苷类、呋喃类、生物碱类、氨基酸蛋白质类、油脂类、甾醇类、无机离子类、有机锗等十大类化合物。目前研究较多的是灵芝多糖，具有抗肿瘤、抗氧自由基、抗衰老、提高免疫力、活血化瘀等生物活性[1]。灵芝酸是近年来从灵芝中分离得到的一类具有广泛药理活性的物质，是当今灵芝研究的一个热点。研究表明灵芝酸具有降低胆固醇、护肝排毒、抑制组织胺释放、止痛、镇静、毒杀肿瘤等功能，是灵芝的主要有效成分之一。本文对灵芝酸抗乳腺癌细胞株MCF-7作用进行实验。

1 资料与方法

1.1一般资料 DMEM培养基（购自Gibco公司）及培养用胎牛血清（FCS，天津TBD），MTT，0.25%胰酶购自上海公司；青、链合剂、碳酸氢钠，DMSO溶液，台盼蓝， PBS溶液为本院中心实验室提供。灵芝酸购自南京中医药大学，细胞株MCF-7人乳腺癌细胞株购自ATCC 上海。

1.2方法 MTT检测：癌细胞的体外培养条件：37℃，5%CO2，饱和湿度保湿培养，MCF-7人乳腺癌细胞所用培养基为：DMEM，加入10%胎牛血清，4万u青、链合剂。对癌细胞的抑制作用测定：将新鲜培养的细胞制成1×104/mL的悬液，移接于96孔细胞培养板中，每孔200μl，加入不同浓度的灵芝酸样品，培养24、48、72h后进行测定。MTT检测：细胞处理24、48、72h后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育4h，停止培养。小心吸去孔内培养上清液，每孔加入100μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值（OD），OD值与活细胞数量成正比。细胞存活率=实验组光吸收值/对照组光吸收值；药物抑制率=（1-实验组光吸收值/对照组光吸收值）×100%。

2 结果与分析

MTT检测结果如表：测得结果的显著性均以（x±s）表示，用t检验进行分析处理。见表1、表2。

灵芝酸生物活性如图1（图1为3d测定结果）。

3 讨论

我国对灵芝有效成分的研究已有较多报道，但多局限于灵芝多糖的研究，在灵芝酸研究方面开展较少。虽然灵芝酸种类达上百种之多，但在灵芝中的含量却很低，仅为 0.15%～1.2%左右。我们对从灵芝中提取分离获得的灵芝酸进行了抑制乳腺癌细胞株MCF-7的研究。

目前用于细胞和细胞因子活性检测采用同位素、台盼蓝法和MTT等方法。前两者虽然有各自的优点，但存在着一定的局限性，如操作过程复杂，检测周期长，需要特定的仪器设备，易污染环境等缺点。MTT比色法以其快速、灵敏、简便、准确等优点受到广泛的应用。其基本原理为：MTT，即溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑，简称四唑盐，又名噻唑蓝；MTT产品为淡黄色粉末，易被水溶解和透过细胞膜而进入细胞内，MTT可被活细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶还原，形成不溶于水的蓝紫色结晶（Formazam），死细胞则无此功能。该结晶可溶于酸性异丙醇、二甲基亚砜、SDS等有机溶剂中，通过多孔扫描分光光度计依颜色深浅可测定出各吸光度值。由于结晶物形成的量与活细胞数量及代谢活性成正比，因此吸光度值的大小可反映出细胞的数量及活性。

本实验观察到与对照组比较，0.5% CMC-Na对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的生长无抑制及毒杀作用，且与作用时间无关。灵芝酸浓度在50μg/ml时，48h内对MCF-7细胞的生长无明显抑制作用（P>0.05），而72h后作用明显（P<0.05）。结合光镜观察，发现其以抑制作用为主。在100μg/ml时共育72h后，对MCF-7细胞的生长具有明显抑制作用（P<0.01）。在200μg/ml时共育24h后，对MCF-7细胞的生长具有明显抑制作用（P<0.05），72h后抑制作用更为显著（P<0.01），这与Gao[2]等和Wu[3]等的结果相符。IC50（半数抑瘤浓度）值为150μg/ml。随药物浓度增加，对MCF-7的作用呈增长趋势，且与作用时间呈正相关，这种现象可能与抑制信号传导有关。

从表2可以看出，共育24h后，除50μg/ml的浓度外，其余各浓度均有明显效果。而50μg/ml的灵芝酸浓度之所以无效，我们考虑是由于浓度较低，作用时间较短所致，随作用时间的延长，其抑制效果也很明显。3d平均药物抑制率为56.66%。

现代研究[4]表明，机体抗肿瘤机理主要依赖于细胞免疫功能，而担负细胞免疫功能的细胞主要是体内的T细胞和NK细胞。NK细胞是一种不依赖胸腺、抗体和补体就能直接杀伤肿瘤的细胞，其活性的增加可抑制肿瘤生长和转移。

本实验是体外试验， 与体内实际效果必然有一定差别。在体内癌细胞增殖与宿主的代谢、与体内的药物相互作用是非常复杂的，受到药物剂量、给药方式、体内环境、联合用药等多种因素影响，所以灵芝酸对乳腺癌的作用尚需结合临床情况全面考虑。此外，尚需进一步实验探索，从分子水平探讨灵芝酸抗肿瘤作用的机制。

展望：初步研究已证实灵芝酸具有抗人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的作用，但尚需进一步实验探索，从分子水平探讨灵芝酸抗肿瘤作用的机制。需进行实验探索灵芝酸抗其他肿瘤细胞的效果。进一步开发灵芝酸的其他药理活性。

参考文献：

[1]张卫国，刘欣，陈永泉.灵芝多糖的研究进展[J].饮料工业，2003，6（4）：5-10.

[2]Gao JJ， Min BS， Alm EM， et al. New triterpene aldehydes.lucialdehydes A-C， from Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against murine and human tumor cells[J].Chem Pharm Bull，2002， 50（6）： 837-840.

[3]Wu TS， Shi LS， Kuo SC. Cytotoxicity of Ganoderma lucidum triterpenes[J].J Nat Prod 2001，64（8）：1121-1122.

[4]梁军，孙朝阳，李予蓉.灵芝 912对受照小鼠免疫功能的影响[J].中华放射医学与防护杂志，2003， 23（1）：46-47.

编辑/哈涛

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