脱氧核糖核酸甲基化分析方法在肿瘤诊断和治疗中的应用

摘 要 脱氧核糖核酸（DNA）甲基化是表观遗传改变的主要作用方式，在基因表达调控、基因组印迹、胚胎发育、维持正常细胞功能等过程中起着极其重要的作用；异常甲基化可以导致肿瘤的发生、发展。因此，探讨甲基化形成与改变的可能机制，建立准确性好、灵敏度高、操作简单的DNA甲基化分析方法，可为某些肿瘤的早期诊断提供重要依据。本文综述了DNA甲基化的几种重要分析方法，着重介绍了直接测序法、甲基化特异性PCR方法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光法、电化学方法以及光度分析法等的原理及优缺点；并介绍了DNA甲基化在肿瘤诊断和治疗中的应用；最后展望了DNA甲基化分析检测方法的研究前景及应用。

关键词 脱氧核糖核酸； 甲基化； 肿瘤诊断； 肿瘤治疗； 评述

1 引 言

脱氧核糖核酸（DNA）甲基化是指在DNA甲基转移酶（MTase）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基转移到DNA链中特定碱基上的过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观遗传修饰方式之一，常发生在细胞的癌变过程中，是研究最为深入的一种表观遗传学调控机制，是后天性基因沉默的一种重要决定性因素，与染色体结构、转录调节、外源DNA侵袭时细胞的自我保护密切相关。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤等。在原核生物中，甲基化常发生在GATC和CCATGG碱基序列中；在哺乳动物中，甲基化主要发生在胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（5′-CpG-3′）的胞嘧啶（C）上，即在MTase作用下，CpG二核苷酸的C转变为5-甲基胞嘧啶（5mC），反应如下：

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高等生物的DNA链中有两种形式的CpG位点： 一种CpG位点分散于DNA链中，另一种CpG位点在DNA链的某些区域高度聚集，可达均值的5倍以上，通常含有20～30个CpG位点，成为C和G的富集区，这个区域称作CpG岛。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛。健康人类基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在岛外的CpG位点则是甲基化的，这种甲基化的形式在细胞分裂过程中能够得到保留。大量研究表明，非正常DNA甲基化常发生在CpG岛，能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达；还可使DNA失去限制性内切酶的切割位点及DNA酶的敏感位点，使染色体高度螺旋化、凝缩成团、失去转录活性。另外，甲基化的C可脱氨基生成胸腺嘧啶（T），导致基因置换突变，发生碱基错配；如果在细胞分裂过程中不被纠正，就会诱发遗传病或癌症。CpG岛是幼体突变及肿瘤抑制基因失活突变中重要的发生位点，在人类癌症中，约有25%的p53基因突变发生在CpG岛；当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达丢失。因此，研究甲基化形成与改变机制，建立准确性好、灵敏度高、操作简单的DNA甲基化分析方法，不仅可为某些肿瘤的早期诊断提供线索，还有助于治疗甲基化相关肿瘤新药物的发现及筛选。本文综述几种重要的DNA甲基化分析方法，着重介绍它们的原理及在肿瘤诊断和治疗中的应用。

2 DNA甲基化分析方法

根据分析原理的不同，甲基化分析方法可分为直接测序法、甲基化特异性PCR方法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、荧光法、电化学方法以及光度分析法等，这些方法可用于检测基因组整体甲基化水平、分析基因特异位点甲基化程度以及寻找新的甲基化位点等。

2.1 直接测序法

直接测序法是由Frommer等提出的一种DNA甲基化分析方法，其原理是在亚硫酸氢盐（Bisulfite）作用下，将DNA中未甲基化的C脱氨基转化为尿嘧啶（U），再经PCR扩增转变成胸腺嘧啶（T），但甲基化的C不发生脱氨基转化；经过处理后，DNA链包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异；最后对PCR产物进行测序并与未处理的序列比较，判断DNA甲基化水平。Hiltunen等应用该方法分析了人类结肠癌基因中APC基因启动子区域的甲基化情况，结果表明，结肠癌患者在APC基因启动子区域的CpG位点呈现高甲基化状态。Liu等应用该方法对宫颈癌标本中的人乳头瘤病毒（HPV）DNA L1区序列的甲基化进行了研究，由此发现并检测到了HPV少见的特殊类型，因此，该方法不仅可以测定甲基化程度，还可提供HPV型别的突变信息。该方法准确性好、可靠性高，能检测出目标片段中每一个CpG位点的甲基化状态；但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，且耗时。

2.2 甲基化特异性PCR方法

甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR）技术是Herman等在直接测序法基础上发展的一种方法。该方法以亚硫酸氢盐处理后的DNA产物作模板，加入甲基化特异性的引物或未甲基化的引物进行特异性的扩增检测。两对引物都具有很高的特异性，若用甲基化特异性引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；若用未甲基化引物能扩增出片段，说明该检测位点未甲基化。该方法是一种高效、特异、灵敏的DNA甲基化分析检测方法，并且所需DNA量很少，但不能反映出整个CpG岛甲基化程度。

2.3 高效液相色谱及高效毛细管电泳法

高效液相色谱法（HPLC）和高效毛细管电泳法（HPEC）是分析DNA甲基化的常用方法，它们都能准确地定量测定整体DNA甲基化水平。Kuo等首先报道了HPLC方法在测定DNA甲基化方面的应用，将DNA样品经酸或酶裂解为碱基，再经HPLC分离出各种碱基，通过计算5mC/（5mC＋5C）的面积比可得到整体DNA的甲基化水平。该方法已成为检测DNA甲基化的标准方法。

邓大君等对该方法作了进一步发展，他们将变性高效液相色谱技术（DHPLC）与PCR技术联用，发展了DHPLC方法用于DNA甲基化的分析。将亚硫酸氢盐处理的DNA产物进行差异性扩增，处理后的样品注入到色谱柱中，进行梯度洗脱。在合适的变性温度下，甲基化的DNA在色谱柱中保留的时间比未甲基化的明显延长，通过比较和分析它们的保留时间可以得到DNA甲基化程度。该方法特别适用于分析构成复杂、同时存在甲基化和非甲基化模板的组织样品；该方法可获得DNA一级结构变异的信息，可用于高通量混合样本检测，能够测定整个扩增区域内CpG位点的甲基化，但不能对甲基化CpG位点进行精确定位。

与HPLC相比，HPEC方法具有简便、快速、经济等优点。Fraga等用HPEC测定了DNA中5 mC的水平；张敏等用该法检测了系统性红斑狼疮（SLE）患者的DNA甲基化水平，结果显示，SLE患者DNA甲基化水平低于正常对照组，差异有统计学意义。

2.4 荧光检测法

荧光检测法是由Dennis等提出，并应用于p16基因的甲基化水平分析的一种方法。该方法也是先用亚硫酸氢盐处理待测DNA，然后设计一个与待检测区域互补的探针DNA，探针的5′端连接荧光报告基团，3′端连接荧光猝灭基团，随后进行实时定量PCR；在反应过程中若标记的探针DNA与待测DNA杂交，利用TaqDNA聚合酶的5′到3′端外切酶活性使荧光报告基团和猝灭基团分离，开始发出荧光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及程度；若标记的探针DNA不能与待测DNA杂交，则引物延伸不能跳过未甲基化位点，荧光报告基团未受到切割，则不发荧光。根据同样的原理，也可对引物进行荧光标记，并通过不同标记的组合，检测多个位点的甲基化水平。Eads等用该方法研究了人类结肠癌MLH1错配基因组的甲基化程度，结果表明，该方法能区分该基因组中单等位基因和双等位基因的甲基化情况。杨晓菲等应用该方法对原发性肝癌（HCC）的潜在肿瘤标志物MAGE-A1、A3基因异常甲基化改变进行了临床血浆标本的检测，证明了该方法可用于临床检测。荧光分析法具有灵敏度高、准确性好、重复性好、分析速率快、所需样品量少、PCR产物污染少、能实时监测并可对大量的样本进行测定等优点，而且可以做多样本、多基因位点的快速分析；但需要特定荧光探针，测定每个位点都需要一对引物及一条荧光双标记的寡核苷酸探针DNA，且影响因素较多。

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