JLN综合征中国家系研究新发现的KCNE1基因错义突变

【摘要】 目的：对伴发室性心律失常电风暴的Jervell-Lange-Nielsen综合征（JLNS）（先天性QT间期延长综合征伴先天性耳聋亚型）一家系进行基因突变检测，以期发现中国人特有的基因突变。方法：采用聚合酶链反应（PCR）及DNA直接测序法对JLNS一家系进行KCNE1检测。结果：先证者及7位家系成员的KCNE1基因的第112位外显子发现一错义突变：A→G，致丝氨酸密码子（AGT）变成甘氨酸密码子（GGT）。结论：JLNS可由KCNE1基因的突变引起，KCNE1基因第112位A→G错义突变是首次发现的中国JLNS的突变基因及位点。

【关键词】 QT延长综合征； 基因； 突变

Newly Discovered Missense Mutation of KCNE1 Gene in Chinese Family Study of JLN Syndrome/DING Xuanyi，DING Chandong，YANG Erli，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（03）：139-142

【Abstract】 Objective：To detected gene mutation in Chinese family with Jervell-Lange-Nielsen syndrome（JLNS） associated with electrical storm of ventricular arrhythmia（congenital long QT syndrome with congenital deafness subtype），in order to find a specific gene mutation in Chinese.Method：Polymerase chain reaction（PCR） and direct sequencing of DNA were used to detect KCNE1 in a family of JLNS.Result：A missense mutation was found in the 112nd exons of the KCNE1 gene of the proband and 7 members of family：A→G，causing serine codon（AGT） to turn into glycine codon（GGT）.Novel heterozygous mutation in the exon 112 of KCNE1 was identified in proband and 7 of 9 her relatives，nucleotide A was replaced by G，which led to change of amino acid.Conclusion：JLNS can be caused by the mutation of the KCNE1 gene，and the A to G missense mutation of the 112nd gene of the KCNE1 gene is the first found mutation gene and site of the Chinese JLNS.

【Key words】 Long QT syndrome； Genes； Mutation

First-author’s address：Hefei No.1 Middle School，Hefei 230601，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.038

先天性QT间期延长综合征（long QT syndrome，LQTS）是一种家族遗传性疾病，临床表现为QTc间期异常延长、反复发作致命性心律失常导致晕厥甚至猝死，同时伴有或不伴有先天性耳聋，并且称伴有先天性耳聋的为Jervell-Lange-Nielsen综合征（JLNS），不伴先天性耳聋的称Romano-Ward综合征（RWS）。其中，JLNS是较RWS更为罕见的类型[发病率（1～6）∶1 000 000]，JLNS患者发生晕厥和猝死等恶性事件的概率也更高[1-2]。由于JLNS是罕发疾病，目前国内外深入研究较少，国外先前研究发现JLNS发病与KCNQ1或KCNE1基因突变有关，但国内研究仅有KCNQ1基因突变的病例报道[3-5]。安徽医科大学第二附属医院收住了一例发作室性心律失常电风暴（24 h内发生2次以上室性心动过速或心室颤动）的JLNS患者，急诊消融触发心室电风暴的室性早搏病灶，对患者及其家系成员进行了KCNE1基因检测，以便能够进一步推动对JLNS基因突变位点的发现。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 先证者及其家系临床资料 先证者女性51岁，自幼耳聋，近年多次发生晕厥，入院后24 h内心电监护多次记录到室性早搏触发的尖端扭转性室性心动过速甚至短暂心室颤动，可自行缓解，发作时患者意识丧失，四肢抽搐。发作间期心电图（ECG）提示QTc>500 ms。耳鼻喉专科检查提示双侧极重度感音神經性耳聋。符合JLNS诊断：（1）先天性耳聋；（2）QTc>460 ms；（3）有晕厥史或尖端扭转型室性心动过速/心室颤动的发作[6-10]。为降低猝死风险，急诊在三维导航指引下行室性早搏触发病灶的消融治疗[11-16]。该家系来自中国安徽省，共3代、10人（含先证者），均进行ECG及相关临床检查。2例患有先天性听力障碍（先证者及其儿）被诊断为JLNS。

1.2 血样标本的收集与处理 首先抽取患者及其家庭成员的静脉血2～5 mL，进行抗凝处理后冷藏在-70 ℃的冰柜中。

1.3 主要试剂 选择Sigma公司生产的蛋白酶和biostar公司生产的聚合酶、DNTP，以及基因公司生产的试剂盒和试剂等。

1.4 基因组DNA的获取 常规酚/氯仿提取白细胞基因组DNA。

1.5 基因组聚合酶链反应（PCR） （1）引物合成：PAGE方式合成KCNE1基因的3对引物[4]，由广州广譽生物科技有限公司合成，引物序列，见表1。（2）PCR扩增：使用高保真PCR酶KOD-Plus-Neo，以基因组DNA为模板配制以下反应体系（50 μL），见表2。PCR反应程序：94 ℃预变性

3 min，98 ℃变性10 s（循环30次），58 ℃退火30 s（循环30次），68 ℃延伸20 s（循环30次），68 ℃再延伸5 min[4]。

1.6 DNA测序 使用3700DNA测序仪对浓度为5 μmol/L的纯化后的聚合酶反应物进行DNA正反双向测序。为进一步验证检测结果的正确性，使用T-VECTOR对纯化后的PCR产物导入DH5α感受态细胞，经过正反双向检测所提取的阳性克隆质粒发现，直接测序的结果与其相同。

1.7 突变位点的确定 对测序结果KCNE1 DNA全长使用Genebank blast软件进行比对，以便其突变位点的进一步确定。同时经过在Human Mutation Database网站上的进一步确定其无新的突变产生。另选取10名普通人的DNA进行提取并进行KCNE1外显子112的PCR扩增，经直接测序发现在普通人中无该突变点的存在[17]。

2 结果

（1）先证者在三维导航指引下急诊行室性早搏触发病灶消融治疗后，住院期间心电监护及出院随访6个月均未再出现晕厥或恶性室性心律失常发作。（2）基因组DNA提取及PCR扩增结果，见图1、2。（3）测序结果：家系成员除女儿和三舅孙女外其余8人都在KCNE1基因的第112位发生A→G的错义突变，引起丝氨酸密码子（AGT）改变成甘氨酸密码子（GGT）。见图3、4。

3 讨论

JLNS1和JLNS2是目前确定的两种类型的JLNS，其中KCNQ1基因和KCNE1基因分别为JLNS1型和JLNS2型的致病基因[18-19]。在以前的研究中普遍觉得JLNS是由于这两种基因的结合和突变产生的，但经过前一段时间的研究发现，JLNS也可能会因为KCNQ1基因的复杂的杂合突变而产生，患者的体内会产生来自于父方和母方两个方面的杂合突变，这两种突变同时产生并发挥作用[6-7]。本研究结果显示，该家系成员除女儿及三舅孙女外的KCNE1基因第112位外显子发生A→G的错义突变，致AGT变成GGT，使编码的丝氨酸被甘氨酸所代替。按照上述致病基因分型，本研究的先证者系JLNS2型患者。JLNS2型是否也存在杂合突变，目前尚没有报道。本研究初步结果表明，JLNS2型也可以只是KCNE1基因的杂合突变，至于是否合并有其他基因的杂合突变有待于后续研究进一步证实。

KCNE1基因又称minK，由Murai在1989年最先报道，基因定位于21q22.1-22.2，长约40 bp，有三个外显子，其中两个位于5’-UTR，该基因编码的minK由129个氨基酸残基组成，分为胞外区、跨膜区、胞浆区三个部位组成，只有一个跨膜结构，其中胞外区、跨膜区均为小片段。KCNE1基因主要在多种人体组织及外周血白细胞中表达。minK起主要作用机制是辅助α-亚基和β-亚基组成复合离子门控通道，并通过调节α-亚基门控，增强复合离子通道的稳定性。KCNE1在异源表达系统中产生的电流动力学特征与慢速激活钾通道电流（IKs）相似，且心脏各处均有KCNE1的表达，心脏电流由KCNE1蛋白异源多聚体所介导，KCNE1异常可引起恶性室性心律失常的发生，临床表现反复晕厥甚至猝死[8-10]。

而先天性神经性耳聋，则是JLNS和RWS区别的重要表现。造成耳聋的机制为：KCNQ1或KCNE1基因在内耳的血管纹状细胞中发生基因异常突变从而产生异常的亚单位，导致淋巴系统分泌紊乱和耳蜗中室的塌陷，从而引起耳聋的发生[11-12]。本研究结果显示，先证者KCNE1基因突变A→G错义突变，使编码的AGT被GGT所代替，产生结构功能异常的亚单位，是产生先天性耳聋的基础。

Russell等[13]发现，JLNS型LQTS并没有完全遵循隐性遗传的规律，其基因携带者表现出常染色体显性遗传的特点，其QT间期轻、中度延长，并可有晕厥发作，但不伴有耳聋。本研究家系部分成员也存在KCNE1的错义突变，但并没有伴有先天性耳聋。为何出现相同的基因位点突变，只有部分家系成员呈现JLNS表型特征，是否呈现JLNS表型特征的成员还存在其他相关基因的突变，即存在几个基因的复合的杂合突变，尚有很多未知的领域值得探讨[20]。

综上所述，JLNS可由KCNE1基因的突变引起，KCNE1基因第112位A→G错义突变是首次发现的中国JLNS的突变基因及位点。

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（收稿日期：2017-12-15） （本文编辑：董悦）

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