[摘要] 目的：分析外周血中癌胚抗原信使核糖核酸(CEA mRNA)在诊断结肠癌血行转移中的应用价值，评价抗癌中药“卡宁”对结肠癌的疗效。方法：选取结肠癌患者40例作为研究对象，随机分为对照组与实验组，每组20例，应用巢式-逆转录-聚合酶链反应技术(巢式RT-PCR)检测患者服用“卡宁”前后血CEA mRNA的含量。结果：结肠癌患者治疗前，实验组CEA和CEA ｍRNA阳性率分别为32.5％、60.0％；对照组分别为37.5%、55.0％。治疗后，对照组患者CEA和CEA mRNA的阳性率分别为30%、45%；实验组分别为29.6%、41.2%(P＞0.05), 实验组治疗前后CEA与CEA ｍRNA含量有显著性差异(P<0.05)。结论：CEA mRNA是一个实用价值较高的诊断消化系统肿瘤血行转移的指标,抗癌中药“卡宁”可有效治疗结肠癌。
[关键词] 癌胚抗原；mRNA；结肠癌；转移；中药
[中图分类号] R735.3+5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）10（b）-005-03
Nested RT-PCR detecting CEA mRNA expression in peripheral blood of colon cancer patients treated by anti-cancer chinese herb
CHANG Qing 1, ZHANG Jie-xia 2, ZHENG Li-xia 2, MAO Xiao-ling 2
(1.Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, China; 2.The First Affiliated Hospital Guangzhou Medical College of Guangzhou 510120, China)
[Abstract] Objective: To analyze the application value of peripheral blood carcino-embryonic antigen messenger ribonucleic acid(CEA mRNA) in the diagnosis of the hematogenous metastasis of colon cancer, and evaluate the therapeutic effect of the anti-cancer traditional chinese herb “Caning” on colon cancer. Methods: 40 patients with colon cancer were selected as the study objects, and then randomly divided into two groups, control group and experimental group, with 20 patients in each group; then nested RT-PCR was used to determine the CEA mRNA in peripheral blood before and after the administration of “Caning”. Results: Before the therapy with “Caning”, the positive rates of CEA and CEA mRNA in experimental group were 32.5% and 60.0% respectively, and that in control group were 37.5% and 55％ respectively. After the therapy with“Caning”, the positive rates of CEA and CEA mRNA in experimental group were 30% and 45% respectively, and that in control group were 29.6% and 41.2%(P＞0.05). A significant difference of the contents of CEA and CEA mRNA before and after the treatment was shown in the experimental group(P<0.05). Conclusion: CEA mRNA is an index with high practical value in diagnosing the hematogenous metastasis of digestive system cancer,and anti-cancer traditional chinese herb“Caning” is an effective treatment of colon cancer.
[Key words] CEA; mRNA; Colon cancer; Metastasis; Chinese herb
癌细胞的微转移是大肠癌术后复发的重要因素，及时发现微转移对大肠癌复发和预后的判断有重要意义，对指导临床治疗也有特殊价值。微转移的肿瘤细胞数较少，常规诊断技术不能检出。随着分子生物学技术的成熟和完善，检测微转移肿瘤细胞已成为目前国内外研究的热点。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2005年12月～2007年6月我院确诊的结肠癌患者 40例，Dukes分期C+D期28例，腺癌36例，黏液癌4例。40例中，男性28例，女性12例，年龄34～73岁。随机分为两组，实验组(手术、化疗加“卡宁”组)20例，化疗用FOLFOX4方案治疗6个疗程，草酸铂85 mg/（m2·d），静滴5 d；亚叶酸钙(CF)200 mg/(m2·d)，静滴5 d；5-氟尿嘧啶(5-FU)450 mg/(m2·d)，静滴5 d；每4周重复1次，术后4个疗程，隔天服“卡宁”Ⅰ号颗粒1包，次日服“卡宁”Ⅱ号颗粒1包，两者交替，持续4个月；对照组(手术、化疗但未服“卡宁”组)20例。
药物：由广东一方药厂、广州医学院第一附属医院提供纯中药制剂卡宁(Ⅰ、Ⅱ号)颗粒冲剂。卡宁(Ⅰ、Ⅱ号)由纯中药制成，Ⅰ号由白花蛇舌草、制半夏、蜈蚣等组成，有清热解毒、化痰散结、破瘀止痛、扶正驱邪的功效；Ⅱ号由莪术、延胡等组成。
试剂：Trizol试剂购自Invitrogen公司；引物由日本TaKaRa公司合成。
1.2 方法
1.2.1 RNA抽提采用Trizol抽提法。取抗凝外周血20 ml，经白细胞分离液无菌分离后，以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量和提取量，置-80℃备用。
1.2.2 引物①PCR引物。
A: 5"- TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG-3";
B: 5" -TGTAGCTGTTGCAAATGCTT TAAGGAAGAAGC-3";
C: 5" -GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG-3"
PCR反应在两个体系中进行，第1轮引物为A+B，第2轮引物B+C， PCR产物长度为132 bp。
②内参照β-actin引物。
上游引物：5"-CATTGTGATGGACTCCGGAGACGG-3"；
下游引物：5"-CATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAGC-3"
PCR产物长度为232 bp。
1.2.3 逆转录反应1 μg的标本RNA和100 ng逆转录引物在70℃下变性5 min，然后加核酸酶抑制剂25 U（Promega公司），4种核苷酸（dNTP）0.5 mmol/L，逆转录酶2 U，在42℃下反应60 min。
1.2.4 聚合酶链反应第1轮PCR以逆转录产物2 μl，加引物A+B，dNTP 200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U，在PCR扩增仪上，94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，扩增35个循环。第2轮PCR以第1轮PCR产物2 μl，加引物B+C，其他条件同第1轮，扩增30个循环，然后72℃延伸10 min。每次扩增均设空白阴性及阳性对照。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，以分子量标准带鉴别PCR产物位置。
1.2.5 CEA的测定应用ELISA测定结肠癌患者血清癌胚抗原(CEA)水平，以临床参考值＞5 μg/Ｌ作为阳性标准。
1.3 统计学方法
两组间比较采用ｔ检验，两样本间的比较采用χ2检验，采用SPSS统计学软件对数据进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PCR电泳结果
第2轮PCR产物电泳图谱见图1。
图1 第2轮PCR产物电泳图
M：DNA分子量Marker；1-3：分别为患者甲、乙、丙治疗后扩增产物；4-6：分别为患者甲、乙、丙治疗前扩增产物
2.2 治疗前CEA mRNA检测结果
各组结肠癌治疗前CEA mRNA的检测结果见表1。
由表1可知，与健康对照组比较，结肠癌患者组中淋巴结转移和远处转移的阳性率差异均有显著性(总4组间比较χ2=28.766，P=0.000)。
结肠癌患者ELISA和RT-PCR检测结果比较见表2。应用ELISA测定结肠癌患者血清癌胚抗原(CEA)水平，以临床参考值＞5 μｇ/Ｌ为阳性标准；RT-PCR检测CEA ｍRNA。表2结果提示，CEA ｍRNA的阳性率高于CEA，差异有显著性(Ｐ＜0.05)。
正常人CEA ｍRNA的阳性率为0。在初诊结肠癌患者体内CEA和CEA ｍRNA的阳性率分别为32.5%和60.0%。
由表2可知，实验组治疗前后CEA与CEA mRNA均有显著差异(P<0.05)。
3 讨论
结肠癌为我国发病率较高的恶性肿瘤之一，结肠癌的治疗多采用外科手术及应用化疗药物等方法。中医药是结肠癌综合治疗的一个环节。中医认为，本病属脏腑失调、正气虚弱、气滞血瘀、邪凝毒聚而成。针对本病正虚邪实的机制特点，笔者用抗癌中药“卡宁”辅助手术、放化疗治疗消化道肿瘤，全方具有理气活血、解毒散结、健脾益气、清热解毒、扶正驱邪等功效。卡宁(Ⅰ号、Ⅱ号)对肿瘤患者有缓解症状、缩小瘤体、抑制肿瘤生长、减轻痛苦、提高免疫力、延长生命的作用。
CEA mRNA在肿瘤细胞及某几种特定的细胞中有高水平的表达，而在正常体细胞与非肿瘤炎性细胞中几乎不表达。已知游离于细胞外的ｍRNA很不稳定，极易被RNase降解，外周血检测到肿瘤特异或其相关基因的ｍRNA即提示血液中存在完整的能表达该ｍRNA的细胞。大肠癌与其他肿瘤一样，血液播散是其重要特征之一，严重影响其治疗和预后。目前，检测循环大肠癌细胞的标志物中以CEA阳性率及表达率最高，在肠癌中95%表达，而且它拥有较高的敏感性及特异性，因此，CEA mRNA是十分适合检测循环大肠癌细胞的标志物[1]。
从微转移细胞mRNA逆转录到cDNA以识别组织特异性基因的表达。因此，与常规检测CEA蛋白表达水平的方法相比，RT-PCR方法从基因水平上检测CEA mRNA，无疑是一种灵敏度和特异度更高的方法[2]。
本研究结果显示，40例结肠癌患者外周血中CEA mRNA表达阳性情况为：11例无区域淋巴结转移的结肠癌患者外周血中，3例(7.2%)呈阳性表达，15例有区域淋巴结转移的结肠癌患者外周血中，9例(60.0%)呈阳性表达，14例远处转移的结肠癌患者外周血中，12例(85.7%)呈阳性表达。本实验结果提示，结肠癌早期就可能存在癌细胞侵袭至血液循环，患者外周血中CEA mRNA的检出预示着肿瘤的复发、转移和总生存时间的缩短。
虽然RT-PCR较RIA具有更高的检出率，但仍然会出现假阴性结果，可能的解释是：①一些上皮源性肿瘤细胞不产生CEA mRNA，可能与血道微环境的易变有关，使得血循环中的肿瘤细胞不产生CEA mRNA，而在组织产生；②肿瘤细胞入血存在时差，使得单一时段不易捕获肿瘤细胞。至于假阳性的可能原因有：①静脉穿刺时将产生CEA mRNA的皮肤上皮细胞带入血液标本；②血循环中可能存在其他能够产生CEA mRNA的细胞，因为除结肠癌细胞产生CEA mRNA外，胰腺癌、乳腺癌、小细胞及非小细胞结肠癌、甲状腺髓样癌细胞亦可产生[3，4]。因此，本实验抽取20例健康人的外周血作为阴性对照。健康人CEA的RT-PCR结果均为阴性。对照组治疗前后CEA mRNA分别为55.0%和45.0%，实验组为60.0% 和41.2%。
临床上未发现转移者，一旦周围血或淋巴组织出现肿瘤靶分子标志，即意味着可能出现微转移。血清学是最普遍便捷的方法，测定血浆总DNA含量，正常情况下低于10 ng/ml，而在出现转移可能时可超过300 ng/ml。术中检测肠系膜血，阳性者80％无肝转移。以COX模型分析，对比淋巴结转移率与预测肝转移，CEA mRNA检测肠系膜血无意义。CEA mRNA并不能代表完整的能增殖的癌细胞[5,6]。
有学者[7]发现，各期结肠癌患者中35％血清CEA阳性，而69％有CEA mRNA表达。更重要的是，B和C期患者只有20％血清CEA升高，而70％有CEA mRNA阳性。CEA-CEA mRNA系统表达量不同步的原因可能是肿瘤基因组调控紊乱，CEA mRNA转录系统过活跃，导致CEA mRNA过量转录，出现CEA表达低于CEA mRNA表达的现象[8]。
微转移是一个独立的预后指标，基因诊断检测肿瘤微转移对患者预后的判断优于肿瘤分级和分期，可对临床分期的精确、手术方式及清扫范围的确定、建立个体化辅助治疗方案起到重要作用，应用巢式-逆转录-聚合酶链反应技术检测血液标本CEA mRNA指标，对辅助诊断消化系统恶性肿瘤血行转移具有较高的实用价值。
[参考文献]
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[3]Jonas S, Windeatt S, Boateng A. Indentification of carcino-enbryonic antigen producing cells circulating in the blood of patients with colorectal carcinoma by reverse transcriptase polymerase chain reaction [J]. Gut,1996,39(5):717-721.
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[5]杨林赢,卢云涛.CEA-CEA mRNA系统与恶性胸腔积液的研究进展[J].承德医学院学报2003,20(3):251-253.
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[7]郑树,董琦,陈益定.与胃肠道恶性肿瘤转移和预后相关的肿瘤细胞分子生物学特征[J].中华胃肠外科杂志,2004,7(6):429-431.
[8]Morse MA, Nair SK, Mosca PJ, et al. Immunotherapy with autologous, human dendritic cells transfected with carcinoembryonic antigen mRNA [J]. Cancer Invest,2003,21(3):341-349.
(收稿日期：2007-09-15)
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