丹蛭降糖胶囊对肥胖大鼠骨骼肌IRE1α—JNK信号通路的干预效应

[摘要] 目的 探讨丹蛭降糖胶囊对高脂饮食诱导的肥胖大鼠骨骼肌内质网应激（ERs）相关因子肌醇需求激酶1α（IRE1α）、磷酸化IRE1α（p-IRE1α）、c-jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）表达的影响。 方法 30只雄性SD大鼠随机分为普通饮食组（NC组）、单纯高脂饮食组（HF组）、高脂饮食+丹蛭降糖胶囊组（FD组），每组各10只。应用全自动生化分析仪测定骨骼肌三酰甘油（TG）含量；Western blot检测骨骼肌组织IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK的蛋白表达水平。 结果 ①NC组、HF组以及FD组骨骼肌内TG含量分别为（1.87±0.72）、（3.03±0.71）、（2.71±0.58）μmol/g。与NC组比较，HF组大鼠骨骼肌TG含量显著增高（P = 0.005）；与HF组比较，FD组大鼠骨骼肌TG含量明显下降（P = 0.024）。②Western blot检测结果显示，HF组p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK较NC组明显升高（P < 0.05）；FD组p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK较HF组明显降低（P < 0.05）。③Pearson相关性分析发现，大鼠骨骼肌TG含量与HOMA-IR、p-IRE1α/IRE1α及p-JNK/JNK均呈正相关（r = 0.63、0.66、0.57，均P < 0.01）。 结论 丹蛭降糖胶囊可减轻骨骼肌脂质沉积，调节ERs相关IRE1α-JNK通路，从而改善骨骼肌胰岛素抵抗。

[关键词] 肥胖；骨骼肌；内质网应激；肌醇需求激酶1α；c-jun氨基末端激酶；大鼠

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（c）-0009-04

Intervention effect of Danzhi Jiangtang Capsule in IRE1α-JNK signaling pathway of skeletal muscle in obese rats

ZHAO Xiaotong1 CHEN Mingwei1 FANG Zhaohui1 XIA Tongjia2 WANG Youmin1

1.Department of Endocrinology， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Anhui Province， Hefei 230032， China； 2.Department of Endocrinology， the First Affiliated Hospital of Anhui Taditional Medicine University， Anhui Province， Hefei 230031， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Danzhi Jiangtang Capsule on the expressions of endoplasmic reticulum stress（ERs） related factors including IRE1α， p-IRE1α， JNK and p-JNK in skeletal muscle in obese rats fed with high-fat diet. Methods 30 Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into basal diet group （NC group， n = 10）， untreated high-fat diet group （HF group， n = 10）， high-fat diet plus Danzhi Jiangtang Capsule （FD group， n = 10）. The contents of triglyceride in skeletal muscle were measured by automatic biochemical analyzer， and protein expression of IRE1α， p-IRE1α， JNK and p-JNK were determined by Western blot analysis. Results ①The contents of triglyceride in skeletal muscle in the NC group， HF group and FD group were （1.87±0.72）， （3.03±0.71）， （2.71±0.58） μmol/g， respectively. Compared with the NC group， the contents of triglyceride in skeletal muscle in the HF group were reduced significantly （P = 0.005）. In addition， the content of triglyceride in skeletal muscle in the FD group was significantly higher than that in the NC group （P = 0.024）. ②Western blot analysis revealed that p-IRE1α/IRE1α and p-JNK/JNK in skeletal muscle in the HF group were significantly higher than those in the NC group （P < 0.05）. Compared with the HF group， p-IRE1α/IRE1α and p-JNK/JNK in skeletal muscle of the FD group were decreased significantly （P < 0.05）. ③Pearson correlation analysis showed that the contents of triglyceride in skeletal muscle were positive correlated with HOMA-IR ， p-IRE1α/IRE1α and p-JNK/JNK （r = 0.63， 0.66， 0.57， all P < 0.01）. Conclusion Danzhi Jiangtang Capsule can reduce lipid deposition in skeletal muscle， regulate ERs related IRE1α-JNK signaling pathway， thus improve skeletal insulin resistance.

[Key words] Obese； Skeletal muscle； Endoplasmic reticulum stress；Inositol requiring enzyme-1α；c-Jun N-terminal kinase； Rats

目前普遍认为，外周组织的胰岛素抵抗（IR）是2型糖尿病（T2DM）发病的主要病理生理机制之一，其中骨骼肌是IR发生的主要位点[1]。肥胖或T2DM状态下，脂质在骨骼肌中的异位沉积，可导致骨骼肌IR程度进一步加重[2]。近年来内质网应激（ERs）在骨骼肌IR发病机制中的作用逐渐引起人们的关注[3-4]。有研究认为，肌醇需求激酶1α（IRE1α）-c-jun氨基末端激酶（JNK）介导的ERs信号通路参与了IR的发生及进展[5]。

丹蛭降糖胶囊是安徽中医药大学第一附属医院药物制剂中心生产的院内复方制剂。本文作者先前研究发现它可提高肥胖模型大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白4的表达，发挥胰岛素增敏效应，具体机制尚不完全清楚[6]。本实验首先建立营养性肥胖SD大鼠模型，观察大鼠骨骼肌组织中三酰甘油（TG）沉积情况，并应用丹蛭降糖胶囊进行干预，观察其对骨骼肌TG沉积以及骨骼肌ERs相关因子IRE1α、磷酸化IRE1α（p-IRE1α）、JNK、磷酸化JNK（p-JNK）表达的影响。

1 材料与方法

1.1 肥胖大鼠模型建立、分组及给药

清洁级4周龄雄性SD大鼠40只，体重（150±30）g，购自安立实验动物公司。造模前先用基础饲料适应性喂养1周。明暗周期12/12 h，自由摄食、饮水。随机挑选10只大鼠作为普通饮食对照组（NC组），给予普通饲料喂养，至实验结束。其余30只给予高脂饲料喂养，作为高脂饮食组（HD组）。12周后20只符合肥胖模型的大鼠则按体重再随机分为高脂对照组（HF组）、高脂+丹蛭降糖胶囊组（FD组）各10只，继续高脂饮食，同时每组分别给予溶剂（0.9%生理盐水）2 mL/（kg·d）、丹蛭降糖胶囊470 mg/（kg·d）灌胃。NC组继续普通饲料喂养，给予蒸馏水灌胃。治疗持续4周。

1.2 实验方法

1.2.1 标本收集 16周时3组大鼠禁食过夜8 h后，麻醉（10%水合氯醛）状态下准确称取体重，分离采自下腔静脉的血样，离心后获得的血清置-80℃冰箱保存。迅速分离附睾及肾周脂肪，称取内脏脂肪重量。随后分离大鼠股四头肌组织，置于液氮罐中保存以备提取TG。

1.2.2 血液生化指标检测 应用强生稳步倍加型血糖仪检测空腹血糖（FBG）。应用全自动生化分析仪检测TG、总胆固醇（TC）。放射免疫法检测血清空腹胰岛素（FINS）。铜显色法测定血清游离脂肪酸（FFA）。

1.2.3 相关指数计算 胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）以及腹脂指数的计算方法参见作者先前的文献报道[7]。

1.2.4 骨骼肌中TG（IMTG）含量的测定 取100 mg大鼠股四头肌组织，剪碎，制备骨骼肌匀浆[7]，离心半径为15 cm，6000 r/min低温离心10 min（Eppendorf 5804），应用全自动生化分析仪测定骨骼肌匀浆中IMTG含量。

1.2.5 Western blot法检测骨骼肌组织中IRE1α、p- IRE1α、JNK、p-JNK蛋白表达：制备组织裂解液，冰上裂解股四头肌组织，4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清，BCA法测蛋白含量。提取蛋白经100℃ 5 min变性后上样，电泳，转膜，封闭。加入IRE1α（1∶1000）、p-IRE1α（1∶800）、JNK（1∶700）、p-JNK（1∶2000）蛋白一抗，孵育过夜。第2天加入二抗孵育2 h，ECL显影，曝光，扫描。凝胶图象处理系统分析目标条带灰度值，以磷酸甘油醛脱氢酶灰度值作为校正，计算目的蛋白IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），相关性分析采用Pearson检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体重、摄食量、生化指标、腹脂指数和HOMA-IR的比较

HF组的体重、FBG、FINS、TG、TC、腹脂指数、HOMA-IR、FFA均较NC组明显升高（P < 0.05或P < 0.01），摄食量则较NC组明显降低（P < 0.05）；虽然FD组体重、摄食量、FBG、FINS、TG、TC、腹脂指数、HOMA-IR、FFA均较HF组有所降低，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠IMTG含量的比较

HF组IMTG含量显著高于NC组，差异有高度统计学意义（P = 0.005）；与HF组比较，FD组大鼠IMTG明显下降，差异有统计学意义（P = 0.024）。见表1。

2.3 各组大鼠骨骼肌IRE1α、p-IRE1α、JNK、p-JNK蛋白表达的比较

各组大鼠骨骼肌组织JNK及IRE1α的表达比较差异无统计学意义（P > 0.05）；与NC组比较，HF组大鼠骨骼肌组织p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与HF组比较，FD组肥胖大鼠骨骼肌组织p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2、图1。

2.4 骨骼肌内TG含量与HOMA-IR、p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK相关性分析

相关分析发现，大鼠IMTG与HOMA-IR、p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK均呈正相关（r = 0.63、0.66、0.57，均P < 0.01）。

3 讨论

在研究人类营养性肥胖发病机制过程中常采用高脂诱导的SD肥胖大鼠模型。本研究发现，该肥胖模型大鼠的内脏脂肪堆积、糖脂代谢紊乱明显，胰岛素抵抗程度严重，与过去的报道一致[8-9]。

内质网是真核细胞中蛋白质合成、折叠、成熟与分泌的重要细胞器。高脂饮食、缺氧、饥饿、氧化应激、钙离子稳态失衡、药物、自由基侵袭等多种原因可导致ERs的发生。目前研究认为ERs在IR的发生、发展过程中扮演关键角色[3-4]。本研究显示，高脂饮食组大鼠骨骼肌中TG的含量明显增高，TG含量与反映胰岛素抵抗程度的指标HOMA-IR以及ERs状态的p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK均呈正相关。表明在高脂环境诱导的肥胖大鼠中，骨骼肌中脂质沉积增加可能与IR以及ERs的发生存在内在联系。

IRE1是介导ERs信号转导的跨膜蛋白之一，IRE1α是IRE1的主要结构，在许多组织中皆有表达，IRE1α经自身磷酸化被激活，形成p-IRE1α。当ERs长期得不到缓解时，会启动细胞凋亡[10]。IRE1α可能是诱导细胞凋亡过程中关键的信号分子，可通过其激酶的作用，结合肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2），并与凋亡信号调节激酶（TNF-dependent apoptosis-signaling kinase 1，ASK1）共同形成TRAF2-ASK1-JNK复合体，激活JNK通路[11]。JNK是一种丝裂原活化蛋白激酶，一方面可以调节凋亡相关基因Bcl-2，甚至直接激活Bcl家族中Bax基因促进凋亡[12]，另一方面，JNK可通过调节胰岛素受体底物1（IRS1）的磷酸化调控IR的发生[13]。为消除总IRE1α蛋白及总JNK蛋白变化对观察结果的干扰，本研究采用活化后的蛋白指标与相应总蛋白指标比值，即p-IRE1α/IRE1α和p-JNK/JNK来反映IRE1α-JNK信号通路蛋白表达的变化。结果发现，与NC组比较，尽管HF组大鼠骨骼肌组织中IRE1α及JNK的蛋白表达无显著改变，但其 p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK均明显升高，表明HF组大鼠骨骼肌组织存在明显ERs。

丹蛭降糖胶囊是由太子参、丹皮、生地黄、泽泻、菟丝子、水蛭组成的复方制剂。研究表明，丹蛭降糖胶囊可提高肥胖大鼠网膜脂肪组织中PPAR-γ以及骨骼肌中葡萄糖转运体4 mRNA表达，具有改善IR的功效[6，14-16]。然而，在本组资料中，笔者未发现丹蛭降糖胶囊对肥胖大鼠中反映IR状态指标（FINS、HOMA-IR）的显著改善效应。由于FINS以及HOMA-IR难以准确反映大鼠IR状态，而高胰岛素正葡萄糖钳夹技术则为测定IR的金标准，因此上述结果有待进一步研究以明确。同时，本研究还发现，与HF组大鼠比较，应用丹蛭降糖胶囊干预的FD组大鼠中，尽管血清糖脂生化指标无显著改变，但其骨骼肌内TG含量却显著降低。已有研究发现，丹蛭降糖胶囊可下调肥胖大鼠骨骼肌细胞脂肪酸转位酶（FAT/CD36）的表达，降低骨骼肌中TG的含量，从而改善骨骼肌脂质沉积和IR[7]。此外，尽管与HF组大鼠比较，FD组大鼠骨骼肌组织IRE1α、JNK蛋白表达无明显差异，但p-IRE1α/IRE1α以及p-JNK/JNK却均显著降低。上述研究发现提示丹蛭降糖胶囊可能通过改善肥胖大鼠骨骼肌脂质沉积，调节IRE1α-JNK信号通路，缓解ERs，从而改善骨骼肌IR。本研究结果将为揭示丹蛭降糖胶囊改善骨骼肌IR提供了一个新的机制认识。

综上所述，本研究发现丹蛭降糖胶囊可降低肥胖大鼠骨骼肌中TG的含量，缓解ERs，从而改善骨骼肌IR。

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（收稿日期：2014-09-25 本文编辑：任 念）

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