香蕉MuMADS1与泛素激活酶（MuUBA）在采后果实中的相互作用

摘 要 以香蕉MuMADS1为诱饵载体，采后2 d的香蕉果实的cDNA文库为猎物，采用酵母双杂交的方法得到了泛素激活酶E1的基因片段，命名为MuUBA。采用双分子荧光互补技术进一步验证MuMADS1与MuUBA在植物体内的相互作用。荧光实时定量PCR结果表明，MuMADS1和MuUBA在香蕉中子房发育第4个阶段的表达量最高，但是在茎中的表达量很低，表明其在不同的组织和发育的果实中的表达具有协同性。MuMADS1和MuUBA的表达都受外源乙烯和1-MCP的高度调控，推测MuMADS1和MuUBA在香蕉果实的采后成熟过程中具有很重要的作用。

关键词 香蕉；酵母双杂交；MuMADS1；MuUBA；相互作用；采后果实

中图分类号 Q789 文献标识码 A

MADS-box基因编码的蛋白质是一类数量庞大的具有一定保守性的转录因子，主要在植物中被发现，但是在少数动物和真菌中也有报道。MADS的名字起源于4类MADS-box基因，即酿酒酵母的MCM1、拟南芥的AGAMOUS、金鱼草的DEFICIENS及人类的SRF4的首字母。MADS-box基因的功能贯穿于植物的整个生长发育过程，包括根结构的形成[1]，花分生组织的形成和开花[2]，植物光合作用和营养代谢[3]，激素信号的转导[4]，果实的生长发育和成熟[5-6]。

MADS-box转录因子通过与DNA或蛋白质相互作用来调控植物的生长和发育过程[7]。早期在番茄中对MADS-box转录因子的研究发现TM6和TM3存在相互作用[8]。在拟南芥中AGAMOUS（AG）与MADS-box中4个蛋白AGL2（SEP1）、AGL4（SEP2）、AGL6和AGL9（SEP3）存在相互作用[9]。Brambilla等[10]在拟南芥中发现SEP和BEL1能够形成二聚体，调控着子房的发育。另外，MADS-box蛋白还可以跟其它非MADS-box蛋白相互作用，如与组氨酸折叠蛋白NF-YB相互作用[11]。Hsu WH等[12]发现AGL13促进和调控花粉和胚珠的发育。Dong T等[13]在番茄中发现MADS-box转录因子SIMADS1对果实的成熟起到了负调控的作用。尽管在这些方面已经有了很多的研究，但是关于MADS-box的调控机理却知之甚少。

虽然酵母双杂交被应用于很多种植物来研究蛋白质之间的相互作用，但是这种技术在香蕉上的应用很少。笔者从香蕉果实的抑制差减文库中分离了1个D类MADS-box基因，命名为MuMADS1，该基因主要在不同发育阶段的子房中表达，在果实中的表达量很大程度上受外源乙烯的诱导，并且促使乙烯的生物合成和果实的成熟[14]。将其连接到诱饵载体（pGBKT7）上，通过酵母双杂交实验，获得了1个泛素激酶E1的基因片段，并将此基因片段命名为MuUBA。对MuMADS1和MuUBA在香蕉不同组织、果实发育的不同时期以及不同处理条件下的表达特性也进行了研究。研究结果将有助于更好地了解MADS-box基因在香蕉果实发育和成熟过程中的调控机理。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

香蕉（Musa acuminata L. AAA group，cv. Brazilian）取自中国热带农业科学院热带生物技术研究所香蕉基地（澄迈，海南）绿熟期（开花后100～110 d）的果实。挑选具有相似生长发育阶段的香蕉，并且从每把香蕉上取5个香蕉指，分成3组进行不同的处理。其中一组让其自然成熟，第2组用浓度为100 μL/L的乙烯处理12 h，最后一组用浓度为1 μL/L的1-甲基环丙烯（1-MCP）（乙烯抑制剂）处理12 h[15]。处理后的材料放在25 ℃的环境中成熟，选取不同成熟期的果实在液氮中速冻后，储存在-80 ℃冰箱中备用。

1.2 酵母双杂交

酵母双杂交根据MATCHMAKERTM GAL4双杂交系统3（Clontech，http：///）试剂盒进行。采用PCR技术获得含MuMADS1基因的开放阅读框，引物分别是P1： 5-CGGAATTCGAT

GGGAAGGGGTAAGAT-3，P2： 5-CGGTCGACTCAC

GCCGCTGAATCCGC-3。PCR产物用EcoRⅠ and SalⅠ进行酶切，然后克隆到具有EcoRI-SalI酶切位点的诱饵载体pGBKT7上，然后进行免疫检测。同时，根据生产厂家的说明，用采后2 d的香蕉果实总RNA来构建cDNA文库（Clontech，http：///）。随后将构建的诱饵载体和cDNA文库共同转入酵母细胞，总共获得1.5×106个酵母转化株。

1.3 MuUBA的克隆和序列分析

将酵母双杂交技术获得的单克隆于不同营养缺陷型的培养基SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+x-a-gal上进行筛选。用长链PCR引物扩增得到泛素激酶E1的片段，所用的引物如下，P1： 5-CTAT

TCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3，P2： 5-

GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3。PCR反应条件为：94 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30个循环。得到的PCR产物克隆到PMD-18T（购自TaKaRa公司）载体并进行测序，BLAST（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行序列比对，采用NCBI（http：//.cn/qkpdf/rdxb/rdxb201402/rdxb20140216.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文

1.4 RNA的提取和cDNA的合成

使用CTAB法[16]从香蕉的根、茎、叶、花、果实和不同发育阶段的子房以及不同处理条件下的果实中提取总RNA。cDNA第一链的合成使用了SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit试剂盒（Clontech，Palo Alto，CA，USA），根据试剂盒说明进行反转录。

1.5 荧光实时定量PCR

2 结果与分析

2.1 酵母双杂交分离得到MuUBA

酵母双杂交筛选到的泛素激酶E1的片段大小为389 bp，命名为MuUBA（图1-A）。生物信息学分析结果表明，MuUBA在它的C末端具有保守结构域KVVDLVAKVEDVVVACEDE-DVDIPL-SIYFR，属于UBA家族中的一员（图1-B）。

2.2 MuMADS1和MuUBA在香蕉不同组织和果实发育的不同阶段中的表达

RT-PCR分析结果表明，MuMADS1和MuUBA都是在子房发育的第4阶段（Ov4）表达量最高，这个阶段是香蕉果实迅速生长发育时期。在Ov4时期，MuMADS1和MuUBA的相对表达量分别达到了7.59和12.94，在开花时期，它们的表达量分别为1.88和1.60。这两个基因在茎中只有极少量的表达（图2）。这些结果表明基因MuMADS1和MuUBA在不同的组织和果实发育的不同时期的表达具有协同性。

2.3 乙烯和1-MCP共同调控MuMADS1和MuUBA的表达

在自然成熟的香蕉果实中，MuMADS1和MuUBA的表达量是逐渐上升的，分别在采后的第12天和18天达到最高峰，然后下降（图3-A）。在外源乙烯的处理下，MuMADS1和MuUBA的表达量迅速上升，达到峰值10.69和169.78，与自然成熟的果实相比提前了7 d和16 d（图3-B）。在1-MCP的处理下，MuMADS1和MuUBA的表达都强烈地受到了抑制，只保持在一个很低的表达水平（图3-C）。结果表明，MuMADS1和MuUBA可能共同参与乙烯对果实成熟过程的调控。

3 讨论与结论

在不同的真核生物中，MADS-box蛋白是作为一类转录因子存在的，它在植物的生长发育过程中起到了很重要的作用，这种作用是通过与其它蛋白质形成同源或者异源二聚体或者蛋白复合物而实现的[7]。前期的研究结果表明，MuMADS1主要在发育的子房中大量表达，在根中也有少量的表达，并且与乙烯的生物合成途径和果实的成熟过程密切相关[12]。同时，香蕉果实的成熟和大量基因的表达都起始于采后第2天[17]，因此，本研究以香蕉MuMADS1为诱饵，采用酵母双杂交技术从采后2 d果实的猎物cDNA文库中分离到了泛素激酶E1的基因片段，命名为MuUBA。MuUBA含有UBA家族中的保守序列，这些结构是与它所具有的激活功能密切相关的（图1）。

泛素蛋白在很多生物途径中起到了至关重要的作用，如细胞的生长、植物激素应答的信号转导途径、光合作用等[18-20]。泛素化途径水解目标蛋白时，首先在目标蛋白之间通过形成一个硫酯键，在泛素激活酶E1的活跃位点上存在1个半胱氨酸，这样可以激活泛素[21]。E1酶催化ATP耦联激活反应中关键的第一步，通过定位反应使得泛素蛋白和特异靶位点结合，其在识别靶蛋白泛素化过程中起到关键作用[22]。本研究发现MuMADS1和MuUBA的相互作用，表明由泛素介导的MADS-box蛋白降解过程可能参与MADS结构域蛋白水平的调节。

对这两个蛋白质在转录水平方面的表达特性进行了进一步的研究（图2），MuMADS1和MuUBA在子房发育的第4个阶段都有很高的表达量，也就是香蕉果实迅速生长的阶段，但是在根和茎中的表达量却很低。这个结果与文献[14]报道过的MuMADS1在子房中表达量高，在根茎中的表达量低的结果相一致。该实验结果也表明MuMADS1和MuUBA在不同的组织和果实的不同发育时期中的表达具有协同一致性。

香蕉是一种典型的跃变型果实，其成熟过程在很大程度上受到外源乙烯的促进及1-MCP的抑制作用，1-MCP作为乙烯的竞争性抑制剂，竞争性结合乙烯受体[15]。本研究中，当用外源乙烯处理香蕉果实时MuMADS1及MuUBA的表达水平都极大增加，并且发现相对于自然成熟的果实分别提前7 d和16 d达到表达高峰。经过1-MCP处理，MuMADS1及MuUBA表达大大受到抑制，在采后0～25d后没有出现明显的表达高峰。这种变化同香蕉果实成熟过程是一致的，表明MuMADS1和MuUBA的表达受外源乙烯共同调节，其在香蕉果实成熟中具有关键作用。另外，本研究结果表明，MuUBA对于乙烯信号的响应速度比MuMADS1快（图3）。基于这两种蛋白相互作用的研究结果，笔者推测MuUBA可以通过翻译后修饰作用来调节MuMADS1的表达。

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