桦褐孔菌β—葡萄糖苷酶基因的克隆与定量表达分析

材料，利用RACE技术，首次克隆得到BGL基因的cDNA和DNA全长序列，利用生物信息学方法对其进行分析，并采用实时荧光定量PCR技术，分析桦褐孔菌菌核形态发育过程中BGL基因的表达模式，为深入研究桦褐孔菌菌核形成的分子机理提供参考。

1材料与方法

1.1供试菌株

桦褐孔菌（I.obliquus）JL01菌株由延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室保存并提供。

1.2主要试剂

普通琼脂糖凝胶DNA凝胶回收试剂盒（美国Omega公司），SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit （日本Clontech公司），TRIzol Reagent（美国Life Technologies公司），SYBR Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）、PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）、pMD 18T载体、Ex Taq酶和LA Taq酶（大连宝生物公司）， Trans 5α Chemically Competent Cell购于北京全式金生物技术有限公司。

1.3桦褐孔菌菌核培养

桦褐孔菌菌核的培养参考文献[19]的方法进行。在栽培袋中暗培养110 d后，桦褐孔菌菌核开始形成。此后，每隔20 d取样一次，共取5个菌核发育时期。每个发育时期重复三次。每次取样时都用滤纸将菌核吸干，然后用锡箔纸包好，放入液氮中速冻，置于-80 ℃条件下保存备用。

1.4总RNA和基因组DNA提取

采用改良CTAB法[19]提取桦褐孔菌基因组DNA。总RNA的提取方法参照TRIzol试剂盒说明书。分别利用琼脂糖凝胶电泳法和核酸蛋白测定仪BioPhotomerer Plus（德国Eppendorf公司）检测提取质量和浓度。参照PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（大连宝生物公司）的操作步骤合成实时荧光定量扩增所用的cDNA。

隋飞飞，等：桦褐孔菌β葡萄糖苷酶基因的克隆与定量表达分析

1.5β葡萄糖苷酶基因的克隆

根据GenBank中登陆的草菇（Volvariella volvacea）、金针菇（Flammulina velutipes）、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、云芝（Trametes versicolor）和地中海嗜蓝孢孔菌（F. mediterranea）等BGL氨基酸的保守序列设计简并引物BGLF（5 ′TNATGCCNTTYATGYTNGC3 ′）和BGLR （5 ′CAYTTRTTNGTNCCNGGCAT3 ′），以cDNA为模板扩增桦褐孔菌BGL基因的中间片段。根据获得的IOBGL基因的保守片段，设计3 ′RACE的两个正向特异性引物：BGLGSP2和BGLNGSP2（表1），获得3 ′端序列，设计5 ′RACE的两个下游特异性引物：BGLGSP1和BGLNGSP1（表1），获得5 ′端序列，具体步骤按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的说明书进行。将保守片段、5 ′RACE和3 ′RACE序列拼接得到的IOBGL基因的cDNA全长。根据cDNA全长序列，设计BGL基因全长的特异性引物BGLfF和BGLfR（表1），分别以cDNA和基因组DNA为模板，扩增IOBGL基因的全长序列。

表1PCR扩增所用引物

1.6基因的生物信息学分析及进化分析

利用NCBI进行BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性分析；用MEGA 6.0软件中的邻近相连法（neighbor joining，NJ）构建系统进化树。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）预测蛋白质的理论等电点和相对分子质量；分别使用SignalP4.1 Server（http：///psort/wolf_psort.html）进行亚细胞定位；利用InterProScan 5（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5）预测蛋白质的保守结构域和功能域。

1.7实时荧光定量PCR分析

以桦褐孔菌CYP（cyclophilin）基因和ACT（βactin）基因作为内参基因。使用Primer Premier5.0设计BGL基因和内参基因所需的荧光定量引物，分别为BGLF和BGLR、CYPF和CYPR、ACTF和ACTR（表1）。以5倍稀释的cDNA为模板，在实时荧光定量PCR仪（Mx3005p，美国Agilent公司）上进行PCR扩增。根据SYBR Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）试剂盒（大连宝生物公司）配置20 μL反应体系：2×SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA模板2 μL，无菌水7.2 μL。反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。反应结束后做熔解曲线分析。每个样品3次重复。根据2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量，通过Excel 2013软件进行绘图。

A～E分别表示培养110，130，150，170，190天；箭头指示取样部位

A～E 110， 130， 150， 170， 190 d； Arrows indicate the sampling sites

图1培养时间及取样部位

Fig.1Location of RTPCR sampling sites at different stages of I. obliquus sclerotium differentiation

2结果与分析

2.1IOBGL基因的克隆与分析

用简并引物进行PCR扩增后，获得1条230 bp的中间片段，该片段与NCBI中已登录的其它真菌的BGL基因片段比对，具有较高的同源性，因此推断该片段是IOBGL基因的部分序列。根据获得的中间片段设计RACE特异性引物进行PCR扩增，5 ′端获得1条长度为745 bp的基因片段（图2 B1），3 ′端获得1条长度为2135 bp的基因片段（图2 B2）。序列拼接获得1条2719 bp的基因序列，序列分析表明，该基因序列包含2583 bp的开放阅读框，编码810个氨基酸，理论等电点为5.57，推测分子量为93.4 kD，稳定系数（instability index）为29.72，属于稳定性蛋白。根据该序列设计全长引物，以基因组DNA和cDNA为模板，经PCR扩增后，分别获得3382 bp和2583 bp的全长序列（图2 B3、B4），GenBank登录号分别为KP970550和KP970549。IOBGL基因的DNA和cDNA比对，发现该基因共含有13个内含子和14个外显子（图3），并且只有8个内含子（图3 III、IV、V、VI、VII、IX、X和XIII），符合GTAG原则。

M：DNA 分子量；B1：5 ′ RACE产物；B2：3 ′ RACE产物；B3：DNA全长扩增产物；B4：cDNA全长扩增产物

M： DNA Marker； B1： 5 ′ fragment； B2： 3 ′ fragment； B3： Fulllength DNA product； B4： Fulllengh cDNA product

图2IOBGL基因克隆电泳图

Fig.2Electrophoresis of IOBGL gene cloning products

方框表示外显子；实线表示内含子；罗马数字表示内含子个数

Exons are shown as boxes and introns（designated by Roman numerals） as solid lines

图3IOBGL基因的结构示意图

Fig.3Distribution of exons and introns in the I. obliquus βglucosidase gene

2.2IOBGL基因编码蛋白的生物信息学分析

2.2.1IOBGL编码氨基酸的同源性分析及结构域预测

氨基酸同源性序列比对发现，该基因编码的氨基酸序列与同科的地中海嗜蓝孢孔菌（F. mediterranea）的BGL基因相似性最高（85%），与其它物种，如密褐褶孔菌（Gloeophyllum trabeum）（67%）、彩色豆马勃（Pisolithus tinctorius）（66%）、大伏革菌（Phlebiopsis gigantea）（65%）、朱红栓菌（Trametes cinnabarina）（64%）和毛韧革菌（Stereum hirsutum）（63%）的氨基酸序列都具有较高的相似性，表明克隆得到的cDNA和DNA序列为IOBGL基因。

蛋白质的保守结构域和功能域预测结果表明，该蛋白属于糖苷酶水解酶第3家族。6323位氨基酸属于糖苷水解酶第3家族的N端结构域；310727位氨基酸为糖苷水解酶第3家族的C-端结构域，该结构域不仅参与催化作用，并且可能涉及到β-葡聚糖的绑定；410551位氨基酸属于PA14结构域，该结构域具有绑定功能；766838位氨基酸为纤维连接蛋白III型结构域（fibronectin type IIIlike domain），它的功能目前还不清楚。

2.2.2IOBGL的亚细胞定位预测

信号肽预测表明该蛋白质序列没信号肽序列；预测IOBGL编码的氨基酸序列跨膜区，结果表明该蛋白没有跨膜区；亚细胞定位预测，结果显示该蛋白定位于细胞质的可能性最大，因此推测该基因编码的IOBGL蛋白属于胞内酶。

2.3IOBGL系统进化树分析

将IOBGL与其它相近物种真菌的BGL蛋白进行亲缘关系比对，系统发育树（图4）结果显示，IOBGL和所选取的8个相近物种真菌的BGL蛋白可以划分为5个分支。其中桦褐孔菌（I. obliquus）BGL蛋白和地中海嗜蓝孢孔菌（F. mediterranea）的BGL蛋白亲缘关系较近，聚为1组；密褐褶孔菌（G. trabeum）、毛韧革菌（S. hirsutum）、大伏革菌（P. gigantea）和黄硬皮马勃（Scleroderma citrinum）聚为1组；印度梨形孢（Piriformospora indica）和皱木耳（Auricularia delicata）分别聚为1组；此外，花耳纲（Dacryopinax sp.）与伞菌纲的真菌亲缘关系较远，位于距离IOBGL最远的分支中，单独聚为1组。

图4IOBGL蛋白与其它物种IOBGL蛋白的系统进化关系

Fig.4Phylogenetic relatedness of IOBGL to other fungal BGL proteins

2.4IOBGL基因的荧光定量表达分析

为了研究IOBGL基因在菌核发育过程中的表达模式，采用实时荧光定量PCR技术分析其在5个菌核不同发育时期的表达水平的变化。结果（图5）表明，IOBGL基因在菌核发育过程中的表达量呈先升高后降低的趋势。在栽培袋中培养170 d的菌核中，IOBGL基因的表达量达到最高，是培养110 d菌核中IOBGL基因表达量的3.68倍。DING[18]等人利用northern blot杂交技术研究BGL基因在子实体形成过程中的表达模式时，发现BGL基因的表达量随着子实体的发育而逐渐增加，与本研究的结果基本一致。

不同小写英文字母表示在P<0.05水平上的差异显著

Different lower case lettersindicate a significant difference at P<0.05

图5IOBGL基因在桦褐孔菌不同发育时期菌核

中的表达情况

Fig.5IOBGL expression level at different stages

of I. obliquus sclerotium development

3小结

本研究采用RTPCR和RACE技术首次从桦褐孔菌中克隆得到的BGL基因的全长序列，并且通过生物信息学分析其编码的氨基酸序列。IOBGL与其它糖苷酶水解酶第3家族中的BGL氨基酸序列比对发现，都包含以下5个保守区：DGP、KHF、SDW、GLD和VLLKN。因此，初步判断IOBGL属于糖苷水解酶第3家族。IOBGL经过多种生物信息学分析，预测其属于胞内酶，胞内BGL水解基质后能够确保产生的葡萄糖不至于流失到胞外，从而提高其利用效率。

由于RTPCR和RACE技术在克隆基因方面的局限性，本研究只克隆得到一种BGL基因。NCBI已登录物种中，与桦褐孔菌亲缘关系较近的地中海嗜蓝孢孔菌（F. mediterranea）的全基因组测序已经完成，其基因组内具有多种BGL基因。然而，桦褐孔菌中是否还有其它的BGL基因尚不清楚，笔者拟在后续研究中采用其它方法获得更多桦褐孔菌的BGL家族基因，研究其整个家族基因在菌核发育过程中的表达变化规律。

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