丹红有效成分配伍对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用

材料

1.1药品与试剂羟基红花黄色素A（天津马克生物技术有限公司，批号120829）；丹参素钠（上海同田生物有限公司，批号12110821）；丹酚酸B（上海同田生物有限公司，批号12091221）；原儿茶醛（中国食品药品检定研究院，批号110810-201007）；M199培养基、胎牛血清（Gibco公司）；D-Hank′s液、Ⅱ型胶原酶、PBS液、胰蛋白酶、兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体、FITC标记山羊抗兔IgG、碘化丙锭（PI）、Folin-酚试剂（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I，PI/RNase Staining Buffer 试剂盒（BD公司）；引物Rat β-actin，MMP-9，ICAM-1，P53（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；High Pure RNA Isolation Kit，Transcrptor First Stand cDNA synthesis kit（Roche公司）；All-in-OneTM Q-PCR Primer Array（GeneCopoeia公司）；其余试剂均为市售分析纯。

1.2动物SD大鼠，雌雄兼用，3～5日龄，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，许可证号SCXK（沪）2008-0016，上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

1.3仪器SW-CJ-2D净化工作台（苏州净化设备有限公司）；3111型CO2培养箱（Thermo Scientific公司）；DMI4000B荧光倒置显微镜（德国徕卡公司）；LDZ5-2型低速自动平衡离心机（北京京立离心机有限公司）；MD SpectraMax Plus384全波长酶标仪（美国Molecular Devices）；BD FACSCulibur流式细胞仪（美国BD公司）；荧光定量PCR仪（BIO-RAD）；eppendorf移液枪，自制缺氧罐。

2方法

2.1rBMECs的原代培养^[4]取3～5日龄SD乳鼠，断头收集脑皮质，用预冷D-Hank′s液漂洗3次后，充分剪碎至1 mm3。以含EDTA的0.25%胰蛋白酶37 ℃消化20 min，5 min摇晃1次，加入含有10%胎牛血清的M199培养液终止消化，吹打均匀，依次通过80目和200目不锈钢筛滤过，收集200目上的团块滤液，1 000 r·min-1离心10 min。弃上清，加入0.1%Ⅱ型胶原酶溶液，吹打均匀，37 ℃消化25 min，每5 min摇晃1次，1 000 r·min-1离心10 min。将下层沉淀用M199培养基漂洗1次，再次离心，沉淀用M199完全培养基悬浮，接种至培养瓶中，37 ℃，5%CO2 培养箱培养，约7～8 d细胞生长成致密单层，出现“铺路石”征象后可进行传代培养，以第3代细胞用于实验。

2.2大鼠脑血管内皮细胞缺氧损伤模型的建立取第3代rBMECs传代于相应的培养器皿中，培养24 h后长成致密单层，把培养液换成M199培养液，放置于缺氧罐（温度37 ℃，持续通入95%N2+5%CO2 的混合气体充满缺氧罐，15 min后封口膜密封缺氧罐接口置于37 ℃恒温箱中4 h。造成细胞缺氧损伤模型。

2.3分组根据MTT法细胞毒性实验结果原儿茶醛、丹酚酸B、羟基红花黄色A、丹参素的浓度分别在0～200，0～100，0～150，0～300 mg·L-1为非细胞毒性剂量，即各药物与细胞共同培养4 h后，细胞存活率大于90%，选取适宜浓度进行下一步研究。在各有效成分的非细胞毒性剂量范围内选取高、中、低浓度，见表1，按照正交试验设计L9（34）原则和M199培养基配成9组含药无血清培养液。以下实验均分11组：正常对照组、模型组、9组给药组。

2.4LDH的测定取各组细胞培养上清液20 μL，每组设置6个复孔，按试剂盒说明书操作，在440 nm酶标仪测定A。

2.5SOD活性和MDA水平的测定去除上述各组细胞培养基，经PBS洗3次后，加入细胞裂解液吹打，使细胞裂解，收集各组细胞裂解液并作好标记，按试剂盒说明书方法测定SOD活性和MDA水平。

2.6流式细胞术检测rBMECs细胞周期及早期凋亡的变化每组设置3个复孔，去除各组细胞培养基，经PBS洗3次，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，终止消化后，分成2份离心收集细胞，其中一份以70%乙醇-20 ℃固定2 h，PBS和stain buffer分别清洗细胞1次，碘化丙啶（PI）染色30 min，流式细胞术检测。另一份加Annexin V binding buffer 500 μL振荡成单细胞悬液，室温下暗室经FITC Annexin/PI双染15 min后，流式细胞术检测。

2.7RT-PCR法检测ICAM-1，MMP-9，P53 mRNA表达应用Trizol提取细胞总RNA，取等量RNA 进行逆转录反应，并使用以下特异性引物进行PCR 扩增鉴定：ICAM-1（NM_012967.1）上游5′-TCTCATGCCCGTGAAATTATG-3′，下游5′- TTGATTCAAAGGAAAGGCTTCT-3′；P53（NM_030989）上游5′-CAGCTTTGAGGTTGGTGTTTGT-3′，下游5′-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA-3′；MMP-9（NM_031055.1）上游5′-ATCTGTATGGTCGTGGCTCTAA-3′，下游5′-TGGCTTCCTCCGTGATTCG-3′；内参β-actin（RIP004）上游5′-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3′，下游5′-CCCATACCCACCATCACACC-3′。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃10 s变性；59 ℃10 s退火；72.0 ℃15 s延伸；循环40次。反应结束后65～95.0 ℃，每5 s增加0.5 ℃溶解曲线，Ct即为完成设置的阈值线和扩增曲线的交点所对应的循环数，可以通过仪器软件直接导出到Excel表中分析。

2.8统计学处理数据用SPSS 13.0统计软件处理，结果用±s表示，组间比较方差齐采用一般的t检验，方差不齐采用近似t检验。

3结果

3.1对缺氧损伤的rBMECs释放LDH及细胞内SOD活性和MDA水平的影响rBMECs 缺氧损伤后，模型组与正常组比较P<0.01，说明缺氧造成脑微血管内皮细胞细胞膜受到了明显的损伤，通透性增加，导致细胞上清液中LDH的释放量显著增多；与模型组比较，丹红注射液4种主要有效成分9个配伍组方都能不同程度地抑制细胞上清液中LDH的增加，其中7，8号组方差异具有显著性意义，1，2，3，9号组方与模型组相比差异有极显著性意义，见表2。

rBMECs缺氧损伤后，模型组与正常组比较，细胞内SOD的活性明显降低，MDA水平显著升高（P<0.01），说明缺氧造成脑微血管内皮细胞产生大量氧自由基，与脂质、蛋白质、及核酸发生反应，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，且脂质过氧化物的分解产物能引起细胞发生氧化应激损伤；与模型组比较，丹红注射液4种主要有效成分9个配伍组方均能不同程度地减轻因缺氧引起的脑微血管内皮细胞氧化应激损伤：在提高胞内SOD活性方面，其中2，4，6号组方差异具有显著性意义，1，7号组方与模型组相比差异有极显著性意义；在降低MDA水平方面，其中3，8号组方差异具有显著性意义，1，2，9号组方与模型组相比差异有极显著性意义；综上得知1，2号组方显著性提高SOD活性，降低MDA水平，一升一降，共同发挥减轻氧化损伤，见表3。

3.2丹红有效成分配伍抑制缺氧诱导的rBMECs早期凋亡rBMECs 缺氧损伤后，计算早期凋亡细胞百分率，正常组仅产生8.47%的早期凋亡细胞，与正常组比较，缺氧模型组则产生高达64.53%的早期凋亡细胞（P<0.01）。说明缺氧诱导脑微血管内皮细胞发生早期凋亡，甚至坏死；与模型组比较，丹红注射液4种主要有效成分9个配伍组方均能不同程度地抑制因缺氧引起的脑微血管内皮细胞早期凋亡，其中2，7号组方分别产生39.29%，35.82%的早期凋亡细胞（P<0.05），1，6，9号组方缺氧造模同时作用细胞4 h后分别产生23.70%，29.04%，25.14%的早期凋亡细胞（P<0.01），见表4。

3.3丹红有效成分配伍对rBMECs细胞周期的影响rBMECs 缺氧损伤后，正常组G1期细胞百分率和S期细胞百分率分别为69.11%，22.93%，与正常组比较，缺氧模型组G1期细胞显著增加到90.99%，且S期细胞明显减少到5.86%（P<0.01）。表明缺氧可诱导rBMECs细胞发生G1/S期阻滞，细胞不能顺利的从G1期过渡到S期；与模型组比较，丹红注射液4种主要有效成分9个配伍组方均能不同程度地减少G1期细胞，其中2，6，7号组方差异具有显著性意义，1，9号组方差异有极显著性意义；增加S期细胞方面，2，6，7号组方差异具有显著性意义，1，9号组方差异有极显著性意义，但与模型组比较，3，4，5号组方甚至降低S期细胞；与模型组比较，其他各组均有不同程度的增加G2期细胞，但与正常组比较，仅有1，6号组方明显增加G2期细胞，其他各组无显著差异，见表5。

3.4丹红有效成分配伍对缺氧损伤细胞MMP-9，ICAM-1，P53 mRNA表达的影响与正常组比较，缺氧模型组P53，ICAM-1，MMP-9 mRNA的表达明显上调（P<0.01）。缺氧后细胞P53 mRNA表达明显上调的后果是能引起G1期阻滞和促进细胞凋亡，与上述结果“缺氧诱导脑微血管内皮细胞发生早期凋亡和G1/S期阻滞”一致，证实P53基因的调节功能体现在G1期校正点的监测，还可通过Bax/Bcl2，Fas/Apol等蛋白，完成对细胞凋亡的调控作用。ICAM-1 mRNA表达上调主要是介导缺氧后细胞发生黏附反应，促进细胞迁移和活化。MMP-9 mRNA表达上调是缺氧后调节细胞因子活性，释放血管内皮生长因子（VEGF）维持血管生成；与模型组比较，丹红4种主要有效成分9个配伍组方均能不同程度地下调目的基因：下调MMP-9 mRNA的表达方面，其中1，3，6，9号组方差异具有极显著性意义；下调P53 mRNA的表达方面，其中2，5，7，8号组方差异具有显著性意义，1，6，9号组方差异有极显著性意义；下调ICAM-1 mRNA的表达方面，其中4，7，8号组方差异具有显著性意义，1，9号组方差异有极显著性意义，见表6。

4讨论

当脑梗死时，脑组织缺血、缺氧，致使脑细胞生理功能破坏，发生一系列病理生化改变，受损脑细胞释放出LDH，再经受损血脑屏障进入血液循环中。同时，机体在病理状态下，LDH活性增强，催化乳酸氧化，此是机体自动调节的保护性代偿机制；且梗死面积越大，细胞破坏越多，LDH活性越增。说明LDH在急性脑梗死脑组织损害时是最敏感的酶^[5]。本研究发现，丹红有效成分配伍均能不同程度地降低LDH活性，其中7，8号组方差异具有显著性意义，1，2，3，9号组方与模型组相比差异有极显著性意义。

在脑缺血性损伤机制中，自由基连锁反应被认为是造成脑组织损害的重要机制之一，缺血后再灌注可促发自由基的连锁反应，加重缺血性损伤，造成严重的神经元坏死^[6]。脑组织中富含脂质，易与自由基发生脂质过氧化反应而形成大量的脂质过氧化物，研究发现^[7]，脑缺血及再灌注组SOD活性均明显降低，MDA含量明显升高。从而证明了自由基参与了脑缺血再灌注损伤的过程，SOD阻断此过程，不同干预方法，治疗脑缺血，与降低MDA含量，升高SOD的活性有关。本研究发现，丹红有效成分配伍均能不同程度地降低MDA含量，提高SOD的活性，1，2号组方显著性提高SOD活性，降低MDA水平，一升一降，共同发挥减轻氧化损伤。

ICAM-1是介导内皮细胞与白细胞黏附的重要分子^[8]，目前研究发现其参与调节炎症反应、免疫应答反应等。自发性脑出血血肿周围脑组织炎性反应的前提条件是炎症细胞黏附于血管内皮细胞，黏附分子是介导黏附的重要因素，其中其核心作用的就是 ICAM-1。自发性脑出血后 ICAM-1 使白细胞黏附于血管内皮细胞上，成为活化的白细胞，并产生大量的蛋白水解酶，特别是基质金属蛋白酶、氧自由基和花生四烯酸代谢产物，使血脑屏障通透性增加，导致血管源性水肿，加重脑损伤^[9]。本研究发现，4，7，8号组显著下调ICAM-1 mRNA的表达，1，9号组方下调ICAM-1 mRNA的表达更明显。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）是一类能降解细胞外基质的蛋白水解酶，尤其是MMP-9，可致血脑屏障完整性破坏和血管源性脑水肿^[10-12]。血脑屏障主要由脑毛细血管内皮细胞、血管基底膜以及胶质细胞终足构成，血管基底膜与间质内的细胞外基质是维持血脑屏障完整性的重要结构基础，细胞外基质的重要成分如胶原、纤连蛋白、糖蛋白、脂蛋白等均为MMP-9作用的底物，MMP-9通过降解基膜及紧密连接蛋白ZO-l，使基膜和紧密连接结构破坏从而增加血脑屏障的通透性，引起血管内的水和蛋白外渗，致细胞间隙内水分增多即形成血管源性脑水肿^[13]。MMP-9抑制剂可明显减轻血脑屏障破坏的程度，减轻脑水肿，血脑屏障通透性增强及脑水肿形成与MMP-9增加密切相关。本研究发现，1，3，6，9号组方下调MMP-9 mRNA的表达方面差异具有极显著性意义。

P53是调节细胞应激反应的关键因子。脑缺血激活P53，后者导致神经元凋亡。P53介导神经元凋亡的机制主要有2种，包括转录依赖和转录非依赖途径。在转录依赖途径中，P53通过上调其靶基因p21WAF，Peg3/Pw1或PUMA（受P53基因上调表达的凋亡调控基因）诱导神经元凋亡。此外，P53还干预NF-κB与胸苷激酶p300的结合，进而阻断NF-κB介导的生存信号。在转录非依赖途径中，P53进入线粒体并介导细胞色素C的释放。因此，P53在缺血后脑损伤过程中起关键作用^[14-15]。本研究发现，缺氧后细胞P53 mRNA表达明显上调的后果是能引起G1期阻滞和促进细胞凋亡，与上述结果“缺氧诱导脑微血管内皮细胞发生早期凋亡和G1/S期阻滞”一致，证实P53基因的调节功能体现在G1期校正点的监测，还可通过Bax/Bcl2，Fas/Apol等蛋白，完成对细胞凋亡的调控作用。2，5，7，8号组方下调P53 mRNA的表达方面具有显著性差异，1，6，9号组方下调P53 mRNA的表达更明显。

综上所述，1号组方在抑制LDH的释放量，提高SOD活性，降低MDA水平，抑制凋亡，下调ICAM-1，MMP-9，P53 mRNA表达，最具显著功能，综合分析组方1治疗脑缺血性损伤相对最科学。临床应用过程中可根据病患的实际病症指标调节各配伍方剂量。

[参考文献]

[1]喻明，聂本刚，杨小芳.丹红注射液治疗急性脑梗死380例临床观察[J].现代医药卫生，2013，29（21）：3228.

[2]李淑娇，唐于平，沈娟，等. 药对研究（Ⅷ）——丹参-红花药对[J].中国中药杂志，2013，38（24）：4227.

[3]He Yu， Wan Haitong， Du Yueguang， et al. Protective effect of Danhong injection on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].J Ethnopharmacol， 2012，144（2）：387.

[4]王艳，汪宁，林辰雨.脑微血管内皮细胞的原代培养方法概述[J].中国药理学通报，2013，2（1）：453.

[5]Zhao Shen-ting， Huang Xiao-tian， Zhang Ce， et al. Humanin protects cortical neurons from ischemia and reperfusion injury by the increased activity of superoxide dismutase[J]. Neurochem Res， 2012，37：153.

[6]Gao Jun， Guo Jin， Li Hongxia， et al. Involvement of dopamine D2 receptors activation in ischemic post-conditioning-induced cardioprotection through promoting PKC-e particulate translocation in isolated rat hearts[J]. Mol Cell Biochem， 2013， 379：267.

[7]Pang Xiaoming， Li Tianxia， Feng Liuxin， et al. Ellagic acid-induced thrombotic focal cerebral ischemic model in rats[J]. J Pharmacol Toxicol Methods， 2014， 69（3）： 217.

[8]Zhang Zhi-Guo， Sun Xin， Zhang Qing-Zhu， et al. Neuroprotective effects of ultra-low-molecular-weight heparin on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats： involvement of apoptosis， inflammatory reaction and energy metabolism [J]. Int J Mol Sci， 2013， 14（1）：1932.

[9]Liu Zhenquan， Li Pengtao， Zhao Dan， et al. Anti-inflammation effects of Cordyceps sinensis mycelium in focal cerebral ischemic injury rats[J]. Inflammation， 2011，34（6）：639.

[10]黄小平，谭华，陈北阳，等.黄芪总苷和三七总皂苷配伍对脑缺血再灌注后MMP-9和TIMP-1表达的影响[J].中国中药杂志，2010，35（16）：2187.

[11]Romanic A M， White R F， Arleth A J， et al. Matrix metalloproteinase expression increases after cerebral focal ischemia in rats， inhibition of matrix metalloproteinase-9 reduces infarct size[J]. Stroke，1998，29（5）：1020.

[12]武丽斐，邢月，关亚兰，等. 解毒通络注射液对缺血再灌注大鼠脑水肿的防治作用[J].中国中药杂志，2014，39（6）：1088.

[13]邵华，周德震.三七总苷对急性心肌梗死再灌注病人血清MMP-9表达的影响[J].中国中药杂志，2007，32（15）：1579.

[14]Rui Lan，Yong Zhang，Jun Xiang， et al. Xiao-Xu-Ming decoction preserves mitochondrial integrity and reduces apoptosis after focal cerebral ischemia and reperfusion via the mitochondrial p53 pathway [J]. J Ethnopharmacol，2014，151（1）：307.

[15]Cui D R， Wang L， Jiang W， et al. Propofol prevents cerebral ischemia-triggered autophagy activation and cell death in the rat hippocampus through the NF-κB/p53 signaling pathway[J]. Neuroscience， 2013，246：117.

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