推拿改善T2DM大鼠糖脂代谢性炎性损伤的分子机制研究

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摘要 目的：观察推拿对2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）大鼠腹直肌组织腺苷酸活化蛋白激酶α2（AMPKα2）、核因子-κB（Nuclear Factor-κB，NF-κB）及白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）基因转录及蛋白表达的影响，探讨其改善T2DM大鼠代谢性炎性损伤的分子机制。方法：选取40只Wistar大鼠，随机取出6只为空白组，其余高脂高糖饮食联合低剂量（35 mg/kg）链脲佐菌素腹腔注射建立T2DM模型，成模大鼠32只随机分入模型组、西药组、推拿组及西药推拿组。空白组及模型组每日灌胃蒸馏水，西药组每天以250 mg/kg标准进行二甲双胍灌胃1次，推拿组每日给予推拿手法治疗1次，西药推拿组在相同给药标准基础上每日加用推拿治疗1次。共干预8周，分别记录第2、4、8周的空腹血糖（Fast Blood Glucose，FBG）值，并运用realtime-PCR测定腹直肌AMPKα2、NF-κB及IL-6基因转录，Western-blot测定腹直肌AMPKα2及NF-κB蛋白含量，ELISA测定IL-6蛋白含量。结果：与模型组比较，西药组及西药推拿组FBG在第2、4、8周时显著下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），推拿组FBG在第4、8周时显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与西药组比较，西药推拿组在第4周降糖效果更为显著，差异有统计学意义（P<0.05）；与推拿组比较，西药推拿组在第4、8周时降糖效果更为显著，差异有统计学意义（P<0.05）；与0周时比较，各观察组FBG在第2、4、8周时，均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。与空白组比较，模型组AMPKα2mRNA转录及蛋白表达均下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，西药组、推拿组、西药推拿组AMPKα2mRNA转录及蛋白表达均升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组比较，模型组NF-κBmRNA转录显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，西药组NF-κBmRNA转录下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，推拿组NF-κBmRNA转录及蛋白表达均下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，西药推拿组NF-κBmRNA转录和蛋白表达显著下降，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，西药组、推拿组及西药推拿组IL-6基因转录均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），蛋白表达均显著下降，差异有統计学意义（P<0.01）。结论：推拿可改善T2DM大鼠的空腹血糖，并通过上调骨骼肌AMPKα2基因转录与蛋白表达，下调NF-κB、IL-6基因转录与蛋白表达，发挥其改善糖脂代谢性炎性损伤的手法效应。

关键词 推拿；2型糖尿病；AMPK；代谢性炎性损伤；分子机制

Abstract Objective：To observe the effects of Tuina on the gene transcription and protein expression of 5′AMP-activated protein kinaseα2 （AMPKα2），nuclear factor-κB （NF-κB） and interleukin（IL-6） in rectus abdominis muscle of type 2 Diabetes Mellitus （T2DM） rats.To explore the molecular mechanism of Tuina on improving the metabolic inflammatory injury in T2DM.Methods：A total of 6 Wistar rats out of 40 were randomly selected as the blank group （CON）.Others were feed with high-fat and high-sugar diets combined with low-dose （35 mg/kg） streptozotocin to establish a T2DM model.A total of 32 successfully modeled rats were randomly divided into the model group （MOD），western medicine group （MET），and Tuina group （TNA） and western medicine combined Tuina group （MIX）.The CON and the MOD were perfused with distilled water daily.The MET was daily given a dose of 250 mg/kg for metformin，and the TNA was given daily for manual treatment，and the MIX was given both intervention from MET and TNA.After 8 weeks of intervention，the values of fast blood glucose （FBG） at 2nd，4th，and 8th week were recorded，and real-time PCR was used to measure the gene transcription of AMPKα2，NF-κB，and IL-6 in the rectus abdominis.Western-blot was used to measure the protein expression of AMPKα2 and NF-κB in the rectus abdominis muscle，and the protein expression of IL-6 was determined by ELISA.Results：Compared with the MOD，the FBG of the MET and the MIX decreased significantly at the 2nd，4th，and 8th week （P<0.05，P<0.05，P<0.05，P Key Words Tuina； Type 2 diabetes； AMPK； Metabolic inflammatory injury； Molecular mechanism

中图分类号：R587.1；R244.1 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.12.038

随着社会发展和人民生活水平的提高，2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后另一个严重危害人民健康的慢性非传染性疾病。我国糖尿病的患病率近年来呈快速上升趋势，成人糖尿病患病率达11.6%，糖尿病前期患病率更高达50.1%[1]。既往普遍认为，IR和胰岛β细胞功能衰竭是T2DM的2个主要发病机制，但随着近年来研究的不断深入，相继发现糖脂毒性、慢性炎性反应、微循环功能异常及胰岛β细胞去分化等因素也与T2DM的发病关系密切[2]。其中改善糖脂毒性并控制其引起的慢性炎性损伤已成为T2DM的临床治疗的核心[3]。因此，骨骼肌AMPKα2以其对糖脂代谢及炎性反应的强大调控能力成为了近年来学术界研究的热门靶点，AMPKα2的激活不仅可通过调控GluT4、ACC1/2等分子改善机体糖脂代谢，还可抑制NF-κB信号途径介导机体的慢性炎性反应，从而缓解糖脂毒性对机体的损伤[4]。

近年来，推拿已广泛应用于T2DM的临床治疗，且随着大量临床研究的开展，已基本明确了推拿的临床疗效，但对于手法作用机制的研究当前仍处于起步阶段，本团队在前期研究中已发现推拿可通过调节AMPK/Glut4信号链改善T2DM大鼠的糖代谢水平[5]。因此，本次研究继续对推拿在抑制T2DM慢性炎性反应中发挥的手法效应机制进行了分子层面的深入探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 4周龄SPF级雄性Wistar大鼠40只，体重（100±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.1.2 药物 Streptozotocin（SIGMA，美国，S0130-100），盐酸二甲双胍（源叶生物，1105-70-4）

1.1.3 试剂及仪器 超纯RNA提取试剂盒（康为世纪生物），HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒（康为世纪生物），SYBR FAST qPCR Kit Master Mix（2×）Universal（KAPA Biosystems，美国），AMPKα2抗体（Abcam，英国，ab3760）、NF-κBp65抗体（Abcam，英国，ab16502），大鼠IL-6 Elisa试剂盒（Multisciences）。全自动多功能酶标仪（MULTISKAN MK3，Thermo，美国），荧光定量PCR仪（ABI7500，美国），凝胶成像仪（Tanon-6600，中国）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将40只大鼠适应性喂养于北京中医药大学东方医院实验动物中心SPF级动物房，温度18～22 ℃，相对湿度40% ～60%，自由进食和饮水。1周后随机取出6只作为空白组，其余34只给予高脂饲料（70%普通饲料、10%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供）喂养4周后，禁食12 h，按30 mg/kg一次性腹腔注射1%浓度STZ。空白对照组腹腔注射相同剂量柠檬酸缓冲液。3 d后，以空腹血糖（FBG）≥11.1 mmol/L，视为造模成功。将成模大鼠随机分为模型组、推拿组、西药组及西药推拿组。剔除造模失败及干预中死亡的大鼠，最终各组取材大鼠分别为6只。

1.2.2 干预方法 空白对照組（Control Group，CON）：相同饲养条件下不做任何处理，但在其他组进行干预时，给予相同的鼠袋固定15 min，固定后给予1 mL蒸馏水灌胃，1次/d，共8周。疾病模型组（Model Group，MOD）：干预方法同空白对照组。西药观察组（Drug Group，MET）：将配置好的二甲双胍水溶液，按照250 mg/（kg·d）灌胃给药，并在灌胃给药结束后用相同鼠袋进行固定，1次/d，共干预8周。推拿观察组（Tuina Group，TNA）：将大鼠用鼠袋套住头及胸部（黑暗环境有利于实验大鼠状态平静，治疗依从性高），然后给予推拿干预。具体操作如下：以神阙为中心顺时针揉腹5 min，三指振腹法于小鼠关元、神阙、天枢区域施术5 min，频率（240±10）次/min，行弹拨法于大鼠双侧梁丘血海5 min，频率（120±10）次/min。整套手法共计15 min，手法结束后给予1 mL蒸馏水灌胃，1次/d，共干预8周。西药推拿组（Combined Group，MIX）：首先给予推拿组相同的手法干预，然后给予西药组相同标准的二甲双胍灌胃，1次/d，共干预8周。

1.2.3 组织标本采集及处理 大鼠在末次干预结束当天晚上9点，禁食不禁水12 h后，依次按0.7 mL/kg的剂量腹腔注射5%的水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血后处死，冰浴下（4 ℃冰盘），取腹直肌并快速去除多余脂肪和结缔组织后，放入冻存管内，投入液氮保存，处死动物。随后将动物组织置于-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2.4 指标检测与方法 1）RT-PCR方法检测AMPKα2、NF-κB及IL-6的 mRNA转录水平Trizol法提取大鼠腹直肌总RNA，取1 μg继续反转录程序，得到cDNA溶液，存于-20 ℃备用。引物序列及产物长度见表1，以cDNA做模板，应用real-time PCR仪进行扩增，采用熔解曲线分析方法，首先对基因进行PCR扩增循环，待扩增循环完成后，依据熔解曲线对产物进行分析，以确定产物纯度。采用相对定量法，以GAPDH作为内参基因，△△Ct=（Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组。

2）Western Blot测定AMPKα2及NF-κB蛋白表达水平取各组大鼠腹直肌组织，加入RIPA裂解液，彻底混匀。冰上孵育20 min后，13 000 r/min（4 ℃）离心20 min。取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度上样，SDS-PAGE电泳，转膜后，抗体孵育，ECL显色，胶片曝光。最后，采用凝胶图像分析系统对western blot蛋白杂交条带进行扫描，并用Imagesystem 4.00软件对图像进行灰度分析。相对含量的变化=目的蛋白灰度/GAPDH。

3）ELISA测定IL-6含量取各组大鼠腹直肌组织，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐时两两比较用LSD方法，方差不齐时用Games Howell法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对T2DM大鼠FBG水平的影响 干预前，模型组、西药组、推拿组、西药推拿组与空白组比较，FBG值显著高于空白组，差异有统计学意义；西药组、推拿组、西药推拿组与模型组比较，差异无统计学意义。与模型组比较，西药组FBG值在第2、4、8周时均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），推拿组FBG在第4、8周时显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），西药推拿组FBG在第2、4、8周时均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与西药组比较，西药推拿组在第4周时对FBG调节效应更为显著，差异有统计学意义（P<0.05）；与推拿组比较，西药推拿组在第4、8周時对FBG调节效应更为显著，差异有统计学意义（P<0.05）；与0周时比较，各观察组在第2、4、8周时，均可显著降低FBG，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表2。

2.2 对T2DM大鼠腹直肌AMPKα2、NF-κB、IL-6 mRNA转录及蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组AMPKα2mRNA转录及蛋白表达均下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，西药组、推拿组、西药推拿组AMPKα2mRNA转录及蛋白表达均升高，差异有统计学意义（P0.05）。见表3、图2。

与空白组比较，模型组NF-κBmRNA转录显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，西药组NF-κBmRNA转录下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，推拿组NF-κBmRNA转录及蛋白表达均下降，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，西药推拿组NF-κBmRNA转录显著下降，差异有统计学意义（P<0.01），蛋白表达下降，差异有统计学意义（P0.05）。见表4、图3。

与空白组比较，模型组IL-6 mRNA转录升高，差异有统计学意义（P<0.05），蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，西药组、推拿组及西药推拿组IL-6基因转录均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），蛋白表达均显著下降，差异有统计学意义。

3 讨论

中医理论认为，脾在体合肌肉、主四肢，因此，我国历代医家尤其重视推拿与导引在“脾失健运”相关疾病中的防治作用，本次研究中运用到的核心手法——振腹法主要作用为培元固本，补益肝肾；辅以揉摩天枢以调畅气机，沟通上下；点按梁丘、血海以健脾清胃，化痰降浊。近年来，推拿治疗的疾病谱逐渐由原先的骨伤类疾病向内科慢病的方向回归，在我国T2DM的防治领域推拿有着广阔的应用前景。然而，国内外对于推拿改善T2DM的生物学机制研究尚处于起步阶段，急需相应的基础研究为推拿的临床应用提供现代科学的理论依据。

近年来研究发现，慢性炎性反应参与了整个T2DM的发病过程，其程度与IR及β细胞损伤呈正相关。糖毒性不仅可直接引起外周组织慢性炎性反应，还可通过糖基化终末产物（Advanced Glycation End Products，AGEs）、UPR、己糖胺途径（Hexosamine Pathway）、胰脏淀粉酶沉积、β细胞去分化等途径间接引发组织慢性炎性反应[6]。而脂质的异位沉积引发的脂毒性，可招募炎性细胞浸润，诱导OS、ERS及线粒体功能障碍等病理损伤也被认为是机体慢性炎性反应引起IR及T2DM发生发展的重要机制[7]。

NF-κB作为与免疫调控、介导炎性反应密切相关的核因子，广泛分布于真核生物细胞中，细胞在静息状态下NF-κB的p50/p65亚基与抑制蛋白IκB以三具体形式存在于细胞质中。当受到TNF-α、IL-1β、IL-6及FFA等细胞因子或信号分子刺激后，与其抑制因子IκB解离，继而进入细胞核与相应靶基因结合，发挥转录调节作用。在复杂的炎性反应细胞因子网络中，NF-κB的活化或是其中的一个中心环节，调控着大量细胞因子之间的相互作用[8]。

当前，围绕推拿的免疫调节机制方面的研究正呈现上升趋势。有研究发现按摩可显著提高小鼠的胸腺及脾脏的T淋巴细胞数量，并认为其可作为免疫缺陷相关疾病的辅助治疗方法[9]。亦有学者在治疗肥胖型2型糖尿病的临床研究中，发现推拿联合药物治疗可进一步改善血清炎性反应因子IL-6、TNF-α及CRP水平，使炎性反应水平得到控制[10-11]。本研究从基因与蛋白的层面均反映出了推拿对骨骼肌AMPKα2、NF-κB及IL-6的调节作用，且其对IL-6蛋白的抑制作用可在与二甲双胍联用后进一步加强。尽管有研究[12]表明二甲双胍可通过肝脏AMPK途径抑制IKKα和IKKβ表达，调节相关炎性反应因子，但在本研究中，二甲双胍对骨骼肌NF-κB蛋白表达的抑制作用并不显著。而推拿干预对骨骼肌NF-κBmRNA转录及蛋白表达有显著的抑制作用，且在2种干预方式联用的情况下仍存在这一效应。AMPK作为细胞能量代谢的“开关”，不仅能够调节糖脂代谢，在抑制炎性反应中同样扮演重要角色[13]。而推拿抗炎效应的产生是否由AMPKα2信号网络介导，有待进一步实验验证；如果存在相关性，则推拿很有可能通过AMPKα2的下游分子SIRT1而对NF-κB合成产生抑制效应[14-15]。总之，当前的实验结果为解释推拿在大量T2DM临床研究[16-18]中体现出的抗炎效应机制提供了重要的科学依据。

此外，从对FBG的调节程度来看，与单纯西药或推拿组比较，西药联合推拿组在整个干预周期内体现了更稳定的血糖调控效应。推拿组自身对照显示降糖效应在4周时效果最好，在第8周时血糖值再次升高，这一现象或与老鼠的整体状况随病情进展而恶化有关，提示了推拿的独立降糖能力有限，或更适用于轻、中度T2DM患者的临床治疗。但与模型组的比较仍可以看出，其改善机体炎性反应，减缓T2DM病情进展的作用是可以肯定的。

然而，本次研究仍存在一定的不足之处，如仅对AMPKα2与NF-κB的总蛋白表达进行了测定，在后续研究中应补充对其磷酸化蛋白水平的测定，以便于进一步明确推拿手法对这2个信号分子的活性是否存在调节作用。此外，Irisin[19-20]、LP、ADP、Chemerin[21-22]等肌肉及脂肪因子均存在对AMPKα2与NF-κB的上游调节作用，对这些因子的筛选，也将有利于完善推拿改善T2DM代谢性炎性损伤机制的科学假说。

综上所述，本研究初步揭示了推拿可改善T2DM大鼠的FBG水平，增强骨骼肌AMPKα2基因转录与蛋白表达，同时降低骨骼肌炎性因子NF-κB及IL-6的基因转录与蛋白表达，其与二甲双胍联用可体现较好的协同降糖与抗炎效应。但NF-κB、IL-6与AMPKα2三者间的关联性，仍有待进一步探索。

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（2018-02-06收稿 责任编辑：杨阳）

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