Cx46低表达与晶状体上皮细胞凋亡和年龄相关性白内障的关联分析

[tӓ�z������*'��㨧�&��G���yؚ��Z��m�Ȭ�xn���z{�+azX��ǥ�Ʃ��h�++jׂǎ��~��{�c��~��O��4�*'r[���Ӆ�-�ܝj֝z׫�)޶���ƚ޲Ȩ���ǎ���h��-��^�ǩ��^�&�q�e�+����\�����^w���^u�ޖ�fz{h}���Z��\j֫i����� +v���w��p��ޞǩ��^�&�q�e� h��,�� z��jםq�Z��-��@D �㠱㠱��V���"http://www.hchsfc.com/k/cailiao/" target="_blank" class="keylink">材料与方法

1.1 材料

培养液DMEM、缓冲液PBS（美国HyClone公司），6孔板（美国CoStar公司），细胞冻存瓶、离心管（美国Corning公司），鼠抗人β-Actin单克隆抗体（美国Sigma公司），兔抗人HIF-1α多克隆抗体（美国Abcam公司），辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗、兔二步法试剂盒、DAB显色试剂盒、柠檬酸盐修复液、PBS缓冲液粉末、阳离子防脱玻片、中性树胶（北京中衫生物技术有限公司）。

1.2 细胞的培养、过氧化氢处理和转染

SRA01/04细胞（中国广州吉尼欧生物科技有限公司）培养基为含10%胎牛血清（FBS）和100 mg/mL链霉素的DMEM液，在潮湿、含5% CO2、37℃环境下孵育。细胞生长密度为80%后进行过氧化氢处理。

相应的DNA质粒依据脂质体3000（Invitrogen）使用说明书瞬时转染SRA01/04细胞。

1.3 质粒构建

构建Cx46-GFP融合蛋白，PCR扩增产物，引物序列如下：正向引物5’-CCGCTCGAGATGGGCGACTGGAGCTTTCTGG-3’;反向引物5’-CCCAAGCTTGATGGCCAAGTCCTCCGGTCTGG-3’。然后将扩增产物克隆到经XhoI和HindIII限制性内切酶作用后的GFP载体上。

1.4 细胞活性和MTT分析

利用MTT法分析测定细胞活性。细胞转染和特殊处理后，在5 mg/mL MTT溶液中孵育4 h。移弃上清液，再溶于二甲亚砜溶液中。细胞活性可利用酶标仪测定其492 nm波长处光吸收值。

1.5 凋亡检测

细胞凋亡的检测通过使用33342染料（Sigma公司）观察细胞核形态的改变。细胞平铺于6孔板上培养，经33342染料固定后在显微镜下进行分析。随机选取5个镜下视野统计凋亡的细胞核数量。

1.6 Western blotting实验

经转染以及过氧化氢处理后，SRA01/04细胞裂解提蛋白。将总蛋白直接上样到12% SDS-PAGE胶加样孔内，电泳，PVDF膜转膜，经特异性抗Cx46抗体（抗β-actin抗体作为内参）及二抗孵育后，利用皮尔斯公司的SuperSignal West Pico试剂盒的化学发光底物法，对信号进行可视化。

1.7 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件分析数据。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验分析，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。

2结果

2.1 Cx46低表达与H2O2介导的晶状体上皮细胞凋亡相关

利用Western blotting试验分析比较Cx46在对照组SRA01/04细胞和高浓度过氧化氢条件下SRA01/04细胞中的蛋白表达量。见图1，在100 μM过氧化氢环境中Cx46蛋白的表达水平降低[H2O2 50 μM（177.67±3.65） vs H2O2 100 μM（139.02±2.13）（P<0.05）]，表明Cx46的低表达与过氧化氢介导的晶状体上皮细胞凋亡相关。

2.2 Cx46蛋白在调节由过氧化氢介导的晶状体上皮细胞凋亡中起到重要作用

为进一步阐述Cx46在过氧化氢介导的SRA01/04细胞凋亡中的作用，本研究构建Cx46特异性表达质粒，并通过Western blotting试验确定转染此特异性表达质粒后Cx46蛋白表达量明显增加[vector（133.20±4.50） vs Cx46（181.98±1.30）（P<0.05）]（图2）。

随后本研究进行转染Cx46表达质粒后细胞增殖能力比较。转染Cx46表达质粒，并在H2O2环境下作用24 h后，其OD值为（0.29±0.03），与无H2O2环境下对照组（0.33±0.02）比较，对SRA01/04细胞的增殖具有显著抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05）。在H2O2处理下，转染Cx46表达质粒后，其OD值为（0.29±0.03），与未转染Cx46表达质粒组（0.20±0.01）比较，对SRA01/04细胞的增殖具有显著促进作用，差异有统计学意义（P<0.01）。证实通过转染Cx46表达质粒能够有效地恢复过氧化氢降低晶状体上皮细胞生存能力的水平（图3）。

最后，本研究分析Cx46过表达对过氧化氢介导的细胞凋亡的抑制情况。转染Cx46表达质粒，并在H2O2环境下作用24 h后，凋亡率為（24.36±3.13）%，与无H2O2环境下对照组（6.48±1.34）%比较，SRA01/04细胞的凋亡差异有统计学意义（P<0.05）。在H2O2处理下，转染Cx46表达质粒后，凋亡率为（24.36±3.13）%，与未转染Cx46表达质粒组（43.65±7.51）%比较，对SRA01/04细胞的凋亡具有显著抑制作用，差异有统计学意义（P<0.01）。说明Cx46过表达抑制了过氧化氢介导的SRA01/04细胞凋亡（图4）。这些结果证实Cx46下调是过氧化氢导致SRA01/04细胞凋亡所必须的。

3 讨论

年龄相关性白内障（ARC）位居全世界致盲性疾病首位[1]。调查显示，如果白内障发病时间能延缓十年，其手术量将会减少45%[2]，对整个社会而言将是上百亿元的受益。这些潜在的利益驱使着人们去探索非手术治疗白内障的方法。因而本研究要深入研究并阐明ARC发生发展的具体分子机制。

大量的研究证实氧化应激引起的细胞损伤是白内障发生的主要机制[3-5]。氧化应激在各类晶状体蛋白质（包括酶类、晶状体蛋白和其他伴侣蛋白质）的降解、氧化、交联和聚集等生命进程中均扮演重要角色，同时也是晶状体上皮细胞凋亡的触发点，这些被认为是白内障发生与发展的普遍分子基础[6，7]。过氧化氢产生的氧化自由基存在于眼球的前房内，来源于晶状体上皮细胞的线粒体代谢进程，是晶状体上皮细胞氧化损伤的根源[8]。据报道，白内障患者的房水中表达高含量的过氧化氢，因此，对过氧化氢介导晶状体上皮细胞凋亡的分子机制的认知可能为白内障的诊疗提供新方法。以往研究报道称一些细胞通路和基因在晶状体上皮细胞凋亡进程中扮演着重要角色，例如Caspase3、bcl-2、hGSTA1和hGSTA2等基因[9-12]。但上述这些基因介导晶状体上皮细胞凋亡的详尽机制学研究尚待进一步讨论。

细胞间的缝隙连接是由缝隙连接蛋白组成的跨膜转运通道[13]。其主要功能是介导相邻细胞间离子和小分子物质的直接交换。Cx46是表达于人眼晶状体的一种缝隙连接蛋白，其形成的缝隙连接通道能维持晶状体细胞内部离子和水平衡以及晶状体的透明度和光学特性，同时Cx46也参与调控细胞的很多生命进程，包括生长、增殖、分化、保护及细胞凋亡。在晶状体组织中Cx46的表达对于维持细胞间缝隙连接通道的传递起决定性的作用[14，15]，但是Cx46如何表达和其在晶状体上皮细胞凋亡中起到何种作用的了解却很少。

本研究的目的为进一步详尽地阐述过氧化氢介导的晶状体上皮细胞凋亡的机制。试验数据证实高浓度的过氧化氢（100 μM）是晶状体上皮细胞凋亡的有效诱导物，Cx46的低表达与此凋亡进程相关（图1），并且过表达的内源性Cx46能够抑制晶状体上皮细胞的凋亡（图2和图3）。以上数据表明Cx46是过氧化氢介导晶状体上皮细胞凋亡所必须的，将成为预防年龄相关性白内障发生的新的分子靶点。

研究中發现Cx46的低表达与过氧化氢介导SRA01/04细胞凋亡直接相关（图1），编码Cx46的GJA3基因确切的表达于晶状体上皮细胞，这与Banerjee D等[13]的研究一致，其认为Cx46表达于人类和兔的晶状体上皮细胞，并且于晶状体的功能而言是必须的。以往研究显示Cx46只表达于晶状体纤维细胞[16]，本研究推测，Cx46不仅主要存在于晶状体纤维细胞，同时在上皮细胞中也有表达，并且在晶状体上皮细胞凋亡进程中扮演重要作用。

本研究证实了Cx46低表达与过氧化氢介导晶状体上皮细胞凋亡密切相关，其过表达能够抑制其凋亡进程，意味着Cx46在过氧化氢介导的晶状体上皮细胞凋亡进程中起重要作用，并与白内障的发生直接相关。

[参考文献]

[1] Beebe DC，Holekamp NM，Shui YB. Oxidative damage and the prevention of age-related cataracts[J]. Ophthalmic Res，2010，44（3）：155-165.

[2] Vijaya R，Gupta R，Panda G，et al. Genetic analysis of adult-onset cataract in a city-based ophthalmic hospital[J].Clin Genet，1997，52（6）：427-431.

[3] Bai J，Yang F，Dong L，et al. Ghrelin protects human lens epithelial cells against oxidative stress-induced damage[J].Oxid Med Cell Longev，2017，2017：1910450.

[4] Erol Tinaztepe O，Ay M，Eser E. Nuclear and mitochondrial DNA of age-related cataract patients are susceptible to oxidative damage[J]. Curr Eye Res，2017，42（4）：583-588.

[5] Smith AJ，Ball SS，Manzar K，et al. Ku80 counters oxidative stress-induced DNA damage and cataract formation in the human lens[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2015，56（13）：7868-7874.

[6] Periyasamy P，Shinohara T. Age-related cataracts：Role of unfolded protein response，Ca2+ mobilization，epigenetic DNA modifications，and loss of Nrf2/Keap1 dependent cytoprotection[J]. Prog Retin Eye Res，2017，60：1-19.

[7] Liu X，Liu C，Shan K，et al. Long non-coding RNA H19 regulates human lens epithelial cells function[J]. Cell Physiol Biochem，2018，50（1）：246-260.

[8] Yao H，Tang X，Shao X，et al. Parthenolide protects human lens epithelial cells from oxidative stress-induced apoptosis via inhibition of activation of caspase-3 and caspase-9[J]. Cell Res，2007，17（6）：565-571.

[9] Mao YW，Xiang H，Wang J，et al. Human bcl-2 gene attenuates the ability of rabbit lens epithelial cells against H2O2-induced apoptosis through down-regulation of the alpha B-crystallin gene[J]. J Biol Chem，2001，276（46）：43435-43445.

[10] Tamada Y，Fukiage C，Nakamura Y，et al. Evidence for apoptosis in the selenite rat model of cataract[J]. Biochem Biophys Res Commun，2000，275（2）：300-306.

[11] Bai J，Zheng Y，Wang G，et al. Protective effect of D-limonene against oxidative stress-induced cell damage in human lens epithelial cells via the p38 pathway[J]. Oxid Med Cell Longev，2016，2016：5962832.

[12] Liu XF，Hao JL，Xie T，et al. Nrf2 as a target for prevention of age-related and diabetic cataracts by against oxidative stress[J]. Aging Cell，2017，16（5）：934-942.

[13] Banerjee D，Das S，Molina SA，et al. Investigation of the reciprocal relationship between the expression of two gap junction connexin proteins，connexin46 and connexin43[J].J Biol Chem，2011，286（27）：24519-24533.

[14] Berthoud VM，Ngezahayo A. Focus on lens connexins[J]. BMC Cell Biol，2017，18（Suppl 1）：6.

[15] Slavi N，Wang Z，Harvey L，et al. Identification and functional assessment of age-dependent truncations to Cx46 and Cx50 in the human lens[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2016，57（13）：5714-5722.

[16] Xia CH，Liu H，Cheung D，et al. Diverse gap junctions modulate distinct mechanisms for fiber cell formation during lens development and cataractogenesis[J].Development，2006，133（10）：2033-2040.

（收稿日期：2019-01-30）

推荐访问： 晶状体 白内障 相关性 关联 表达