嘧肽·吗啉胍对烟草PVYN的抑制作用及对寄主防御酶活性的影响

材料与方法

1.1 材料

供试烟草品种为普通烟K326，PVYN由笔者所在研究室分离提纯并繁殖保存在无虫温室中的高感品种K326上。为防止保存期病毒致病性发生变异，在使用前15 d转接到K326烟苗上复壮。

1.2 接种方法

采用常规汁液摩擦接种法接种，当普通烟长至4～5叶期时即可接种。选取长势一致的植株，喷洒400目金刚砂，蘸取接种液轻轻摩擦叶片2～3片，接种后5～10 min用自来水轻轻冲洗叶片，试验在20～30 ℃温室内进行。

1.3 植物体内病毒浓度的测定

1.3.1 处理方法 取长势一致的普通烟K326，接种病毒前24 h与接种病毒后24 h喷洒嘧肽·吗啉胍700倍稀释液、药剂与PVYN等体积混合后1 h摩擦烟叶、喷清水作为空白对照（接种PVYN）。

1.3.2 紫外分光光度计法 取5～6叶期的烟草高感品种K326，处理同“1.3.1”，以喷清水为阳性对照，待阳性对照全部显症时，采取不同对照组发病烟草的上部叶片保存于装有液氮的保温瓶中，提纯PVYN病毒[11]。病毒浓度的测定采用紫外分光光度计（Nanodrop-ND-1000紫外可见分光光度计）法[12]，比较PVYN病毒在260 nm及280 nm处光吸收值之比与标准病毒蛋白与核酸含量的固定比值，用A260 nm来计算PVYN病毒的浓度。

病毒浓度//mg/mL=■

E为消光系数，即在波长260 nm时，浓度为0.1%（1 mg/mL）的悬浮液，光程为1 cm时的光（光密度）吸收值。

标准PVYN的E0.1%1 cm260 nm =2.8，A260/A280=1.28。

1.3.3 ELISA法 取5～6叶期的烟草高感品种K326，处理同1.3.1，处理后每隔2 d取一次样， 采用ELISA法检测不同处理下PVYN的浓度变化。取PVYN的一抗4 ℃包被过夜，洗板后加入样品，室温下孵育2 h。洗板后加入PVYN的二抗，室温下孵育2 h。以PNP溶液为底物，在405 nm下测OD值，并根据标准曲线计算病毒浓度。

1.4 烟草主要防御酶系活性的测定

1.4.1 烟草的处理 选取长势一致的烟草K326进行如下处理：①烟草喷清水作对照；②烟草接种PVYN病毒；③烟草喷嘧肽·吗啉胍。每个处理重复3次，于处理后的1、3、5、7、9、11、13 d取样，于-20 ℃保存。

1.4.2 酶液的粗提 参照逢丽丽等[13]的方法，取1 g样品置于装有液氮的研钵中快速研磨成粉末，加入1.5 mL硼酸缓冲液（0.2 mol/L pH 8.8的硼酸缓冲液含1×10-3 moL/L EDTA、5 mmol/L二硫苏糖醇）继续研磨成匀浆，收集匀浆液，再取1.5 mL上述缓冲液加入到研钵中冲洗残余，将得到的液体转移至同一离心管中，10 000 r/min、4 ℃离心25 min，上清液即为酶粗提液，-20 ℃保存待用。

1.4.3 酶活性测定 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性参照Koukol等[14]的方法测定，多酚氧化酶（PPO）参考薛应龙[15]的方法测定；过氧化物酶（POD）参考朱广廉[16]的方法测定，SOD参考朱春玉[17]的方法测定。以上每个样品重复3次。

2 结果与分析

2.1 药剂处理后植株体内病毒浓度的变化

2.1.1 分光光度法测定结果 采用分光光度法测定药剂处理后的病毒浓度，结果（表1）表明，嘧肽·吗啉胍可以有效地减轻PVYN感染烟草后的发病症状，同时使植株体内的PVYN的浓度降低。接种病毒前24 h喷洒嘧肽·吗啉胍，抑制率为54.90%；接种病毒后24 h喷洒嘧肽·吗啉胍药剂，抑制率为32.71%；药剂与病毒混合后1 h再接种，抑制率高达68.73%，效果最好。本试验结果证实了嘧肽·吗啉胍能降低植株体内的病毒浓度，对病毒的复制和增殖有一定的抑制作用，从而控制PVYN对烟草的危害。

2.1.2 间接ELISA法测定结果 ELISA法试验结果（图1）表明，嘧肽·吗啉胍可以有效的降低植株体内的病毒浓度。嘧肽·吗啉胍与PVYN等体积混合后1 h接种烟草K326，接种后2～3周，寄主植株体内的病毒浓度均低于对照组。接种前24 h和接种后24 h喷药处理的植株体内的病毒浓度，在前12 d均较低，12 d以后寄主体内病毒浓度均有一定幅度的增加，但明显低于对照组，表明该药剂在抑制病毒增殖的某一过程起到一定的作用。

2.2 喷药处理后POD活性的变化

试验结果（图2）表明，接种PVYN及喷洒嘧肽·吗啉胍的烟草体内酶活性明显高于对照。喷洒清水处理的烟草体内POD酶活性从第5天开始上升，第9天开始趋于平稳。接种PVYN后第5天POD活性达到一个小高峰，随后下降，第11天又出现一次高峰，此时POD活性达到最大，随后开始下降，但其活性仍高于清水对照。单独喷洒嘧肽·吗啉胍处理的在第9天出现酶活高峰，而且植株体内POD活性始终高于清水对照，表明嘧肽·吗啉胍可在一定程度上诱导寄主体内POD酶活性的升高。

2.3 喷药处理后PAL活性的变化

PAL作为一种关键酶，在植物苯丙烷类代谢中裂解苯丙氨酸、合成酚类化合物、木质素，与植物抗病性关系密切。试验结果（图3）表明，清水对照处理在第3天到第7天PAL活性急速升高，可能是由于浇水时对烟苗造成机械损伤，诱导PAL酶活性升高；单独接种病毒处理的第7天出现酶活高峰，可能是由于PVYN侵染所致；药剂处理后，烟草叶片中的PAL的活性于第5天达到高峰，随后呈下降趋势，第9天又出现一个小高峰，但始终高于清水及接种PVYN对照组，由此可见，嘧肽·吗啉胍可明显诱导寄主PAL活性的升高。

2.4 喷药处理后PPO活性的变化

试验结果（图4）表明，各处理的PPO活性整体均呈上升趋势；对照在第11天出现酶活高峰，但在整个测定时间里均低于其他2个处理；单独接种病毒处理的第7天出现酶活高峰，可能是由于PVYN侵染所致；单独喷药处理的第11天出现酶活高峰，且均高于其他2个处理。由此可见，嘧肽·吗啉胍可明显诱导寄主PPO活性的升高。

2.5 喷药处理后SOD活性的变化

SOD是抗氧化活性酶，主要功能是专一清除氧自由基。试验结果（图5）表明，3种处理SOD活性波动较大，但整体趋势一致。烟草在喷洒嘧肽·吗啉胍和接种病毒处理第5天之后SOD活性均高于清水对照，喷洒药剂处理组在第5天出现酶活高峰，随后有所降低，但整体高于其他处理。由此可见，嘧肽·吗啉胍可明显诱导寄主SOD活性的升高。

3 结论与讨论

3.1 药剂处理后植株体内病毒浓度的变化

本试验采用紫外分光光度法和ELISA法对喷洒嘧肽·吗啉胍后植株体内PVYN病毒浓度的变化进行检测。结果表明，喷药后植株体内病毒浓度均明显低于清水对照，2种检测方法结果趋势一致，证明嘧肽·吗啉胍对植物体内的PVYN复制和增殖具有一定的抑制作用，从而降低寄主植株体内的病毒浓度，达到防治效果。由于药剂的处理方式不同，其防效也大有不同，说明嘧肽·吗啉胍抑制病毒的作用方式是多方面的，它既可以保护寄主，防止病毒的进入，又可以对寄主起到治疗的作用，还可以在体外使病毒失去侵染能力，但是其作用方式和作用位点尚不清楚，还有待于进一步的研究。

3.2 药剂对烟草主要防御酶系的影响

嘧肽·吗啉胍不仅对PVYN有较好的抑制作用，还可以通过提高寄主植物的抗病性达到防病的目的。防御酶系酶活性的升高与植物抗病性有一定相关性。本试验测定了其对烟草植株主要防御酶系的酶活性，结果表明，嘧肽·吗啉胍可诱导PPO、POD、PAL、SOD酶活提高。

在苯丙烷类代谢过程中，PAL是关键酶，其活性水平除受光、损伤、病害、激素及其他外界条件的影响外，还受内源物质的控制。随着时间的延长，上述3个处理都产生了酶活高峰，可能是由于病毒的繁殖和侵染导致寄主细胞被破坏，从而刺激寄主植物PAL活性的提高。POD参与木质素的聚合作用并清除体内活性氧。近年来许多学者已经认识到POD活性与植物抗病性的相关性，并发现病组织中POD活性明显增强[18，19]。本研究结果表明，各处理POD活性均有不同程度的提高。POD可催化形成木质素和植保素等次生抗性物质，进而可抵抗和限制病毒粒子的侵入和扩散。PPO可催化参与酚类物质代谢，形成的咖啡酸、绿源酸等具有抗病作用，形成的预苯酸是木质素的前提。嘧肽·吗啉胍处理可诱导烟草幼苗产生较高的PPO活性，由它催化所形成的醌类物质限制了病毒粒子的繁殖和扩散。SOD是一种催化超氧化物转为过氧化物的酶，可以阻碍·O2-自由基的形成。所以SOD被认为是·O2-自由基的消除剂。SOD活性高，在一定程度上说明该植株的耐病性或抗病性高。

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