次黄嘌呤核苷酸脱氢酶对猪链球菌2型ZY05719基因转录谱的影响

材料与方法

1.1细菌培养

本研究涉及2株猪链球菌2型菌株，包括强毒菌株ZY、ΔZY。ZY为2005年分离自四川省资阳市发生猪链球菌病的猪组织（由南京农业大学动物医学院微生物组惠赠）；ΔZY为敲除impdh的ZY菌株，由笔者所在研究室构建获得。

细菌在THB（Todd-Heitt broth，BD）平板上进行培养，无菌挑取菌落进入THB液体培养基中，于37 ℃下培养过夜。将此培养物按照1%的接种比例接入新的THB液体培养基中，于37 ℃下培养至细菌对数生长期，革兰氏染色观察细菌形态。

1.2RNA提取和纯化

采用TRIzol Reagent（Life technologies，US）并根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的细菌总RNA抽提。采用Biomate 3S型超微量紫外可见分光光度计（Thermo，US）测定抽提所得总RNA样品的浓度及D260 nm/D280 nm比值，另外经Agilent Bioanalyzer 2100型电泳（Agilent technologies，US）质检合格后使用RNeasy mini kit（Qiagen，Germany）和RNase-Free DNase Set（Qiagen，Germany），纯化总RNA。

1.3样品RNA的放大和标记

采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒、Low RNA Input Linear Amplification kit（Agilent technologies，US）、5-（3-aminoallyl）-UTP（Ambion，US）、Cy3 NHS ester（GE healthcare Biosciences，US），按照标准操作流程对样品总RNA中的mRNA进行放大和标记，并用RNeasy mini kit（QIAGEN，Germany）纯化标记后的cRNA。

1.4芯片杂交

依据SS2-05ZYH33菌株基因序列，定制Agilent公司的8×15 kbp表达谱芯片，该芯片包含2 178个探针（每个探针含60个碱基）。按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，采用Gene Expression Hybridization Kit（Agilent technologies，US），在Hybridization Oven型滚动杂交炉（Agilent technologies，US）中以65 ℃、10 r/min滾动杂交 17 h，杂交cRNA上样量为1.65 μg，并在staining dishes型洗缸（Thermo Shandon，US）中洗片，洗片所用试剂为Gene Expression Wash Buffer Kit（Agilent technologies，US）、Stabilization and Drying Solution（Agilent technologies，US）。

1.5结果扫描

完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner（Agilent technologies，US）进行扫描，用Feature Extraction software 10.7软件（Agilent technologies，US）读取数据，最后采用Gene Spring Software 11.0软件（Agilent technologies，US）对数据进行Quantile算法的归一化处理。每个菌株设3个重复，比较亲本株与缺失株之间差异2倍以上且具有统计学意义（P<0.05）的基因。以上内容均由上海伯豪生物技术有限公司完成。

1.6差異基因的同类群聚类（COG）

参照文献[12]中的方法，将上述筛选的差异基因进行同源群聚类（clusters of orthologous groups，COG）分析。

1.7数据统计方法

对ZY、ΔZY 2组样品的3个重复分别采用随机方差 t-检验，测算2组样品间每个转录本差异表达的显著性强度，差异基因P<0.05有统计学意义。

2结果与分析

2.1细菌形态

ZY与ΔZY经过革兰氏染色，通过显微镜观察1 000倍放大下的形态，可见蓝紫色球菌排列成链状的细菌，ΔZY成链稍长于ZY（图1）。

2.2RNA的质量检测

提取生长对数期细菌的RNA，测定D260 nm、D280 nm，依据D260 nm×稀释倍数×40 μg/mL计算RNA的浓度以及 D260 nm/D280 nm 比值。每个RNA样品电泳后可见3条条带，由大到小依次为23S、16S、5S，依据条带灰度值计算23S/16S比值。D260 nm/D280 nm≥1.8、23S/16S>0.7为合格RNA样本，结果见表1、图2。

2.3ZY和ΔZY表达谱芯片的比较

利用定制的Agilent表达谱芯片比较ZY和ΔZY基因的转录情况。结果表明，有254个基因的转录发生2倍以上显

著水平（P<0.05）的变化，ΔZY菌株中177个基因下调，其中impdh转录下调了99.97%以上，另外ΔZY中上调基因有77个。对这些差异基因进行COG归类，发现impdh的丢失引起了ZY菌株多数基因的转录下调，主要集中于氨基酸、碳水化合物的转运代谢，以及核糖体、细胞壁、细胞膜的生物合成和防御机制，结果见表2。

3结论与讨论

溶菌酶释放蛋白（MRP）和胞外因子（EF）早前被作为 S. suis 2的毒力标记物[13]，后续研究发现，敲除这些因子的S. suis 2后仍对仔猪具有致病力[14-15]。目前尚未明确 S. suis 2关键的毒力标记物，从而限制了对S. suis 2致病机制的认识，同时也阻碍了该病的防控技术研究，因此对S. suis 2毒力因子的进一步研究非常重要。IMPDH已被证实为 S. suis 2一类重要的毒力相关因子，本研究通过定制S. suis 2表达谱芯片，比较了亲本株ZY和impdh缺失株ΔZY之间转录本的差异。结果表明，ΔZY下调基因中直接关系到核糖体蛋白大、小亚基合成的相关基因有18个，占表达谱芯片此类基因总数的32%以上；而ΔZY上调基因中没有关系到核糖体蛋白大、小亚基合成的基因。核糖体是蛋白质合成的机器，由蛋白质和RNA组成，提示impdh基因的丢失下调部分核糖体蛋白质编码基因的转录，可能干扰了核糖体的正常合成，影响细菌蛋白质的正常合成，前期试验表明猪链球菌2型菌株GN061215中也有类似发现[16]。

荚膜为S. suis 2细胞壁外的结构，能够增强细菌抵抗吞噬细胞吞噬的能力，是目前较为公认的毒力因子[17-18]。荚膜组成包括半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、唾液酸，表达谱芯片中包含了荚膜合成基因（cps2A、B、C、E、D、F、H、I、J）和唾液酸合成基因。结果显示，与ZY相比，ΔZY中cps2F、H、I均出现67%以上的显著下调，提示impdh的丢失可能影响ΔZY荚膜的合成。ΔZY防御机制的相关基因中有6个下调，包括ABC多药转运系统、 β-内酰胺酶。ABC系统能够摄取营养、信号分子，并能提供细菌产生耐药性，与细菌毒力密切相关[19]；β-内酰胺酶能够水解一些药物β-内酰胺环而使药物失活，这是病原菌常见的β-内酰胺类抗生素（青霉素类、头孢菌素类）耐药的主要方式[20]，提示ZY可能比ΔZY更容易产生针对此类药物的耐受力。

ZY菌株丢失impdh基因后，引起较多基因的转录下调，且其中部分基因与细菌的致病力存在联系，较全面地解释了ΔZY毒力下降的现象。

致谢：感谢华中农业大学金梅林教授提供猪链球菌2型SS2-05ZYH33基因表达谱芯片探针序列。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.006

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