儿茶素EGCG对Caco—2细胞α—葡萄糖苷酶活性的抑制作用研究

材料与方法

1.1 试验材料

Caco-2细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所；EGCG购自Sigma公司（E4143，纯度 >95%）；DMEM培养液、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素及胰蛋白酶（含0.02% EDTA）均购自美国Hyclone公司；支原体抗生素Plasmocin购自Invivogen公司；cck-8试剂盒和葡萄糖测定试剂盒购自南京建成生物科技发展有限公司；细胞培养瓶以及24孔细胞培养板购自美国Corning公司。

1.2 细胞培养

将处于对数生长期的细胞接种于24孔板，接种密度为4 000个/cm2，于37 ℃、含5%的CO2培养箱中培养。使用DMEM培养液（含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%青霉素/链霉素，1%的L-谷氨酰胺，0.25 mg支原体抗生素plasmocin）培养细胞，隔天换液。

1.3 儿茶素EGCG对Caco-2细胞增殖的影响

采用cck-8法评价200 μmol/L浓度范围内EGCG对Caco-2细胞增殖的影响。细胞接种于96孔板，接种密度为104个/cm2，于37 ℃、含5%的CO2培养箱中培养48 h。弃去旧培养基，分别加入含10、30、50、100、200 μmol/L EGCG的培养液，继续培养24 h。加入10 μL cck-8试剂，37 ℃孵育1 h后450 nm处测OD值。用细胞存活率来衡量EGCG在Caco-2细胞模型上的安全负载量。

1.4 Caco-2细胞中α-葡萄糖苷酶活性检测

Caco-2细胞接种后分别于14、16、18、20、22和24 d检测细胞上蔗糖酶和麦芽糖酶活性。蔗糖、麦芽糖溶液均为28 mmol/L，用磷酸缓冲溶液（PBS，pH 7.4）溶解，过0.22 μmol/L膜抽滤灭菌，37 ℃预热待用。Caco-2细胞弃去旧的培养液，用37 ℃预热的PBS缓冲溶液清洗细胞表面3次。每孔加入1 mL蔗糖/麦芽糖溶液，37 ℃孵育40 min，冰浴结束反应。根据葡萄糖测定试剂盒方法检测产物葡萄糖含量。

1.5 儿茶素EGCG对Caco-2细胞上α-葡萄糖苷酶活力的影响

Caco-2细胞培养至21 d，弃去旧的培养液，用37 ℃预热的PBS缓冲溶液清洗细胞表面3次，加入1 mL含不同浓度EGCG的蔗糖/麦芽糖溶液（28 mmol/L，PBS溶解），37 ℃孵育40 min。冰浴结束反应。阴性测定组加入1 mL蔗糖/麦芽糖溶液（28 mmol/L），空白组加入1 mL PBS缓冲溶液。根据葡萄糖测定试剂盒方法检测产物葡萄糖含量。根据下面公式计算抑制率：

抑制率=[（OD阴性对照组-OD样品测定组）/（OD阴性对照组-OD空白）]×100%

1.6 数据分析

采用Excel软件进行数据分析，试验数据用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 儿茶素EGCG毒理

不同浓度儿茶素EGCG孵育Caco-2细胞24 h细胞活力见图1。从图1可以看出，儿茶素EGCG在浓度达200 μmol/L浓度时，细胞存活率仍大于80%。在此浓度范围内对Caco-细胞增殖无明显影响，可用于后续试验。

2.2 不同培养时间Caco-2上蔗糖酶和麦芽糖酶变化

Caco-2细胞接种24孔板，约7 d后细胞融合，开始分化。从图2和图3可以看出，细胞膜表面酶活性随细胞培养时间的延长而增强。蔗糖酶活性在细胞培养14～18 d之间活性变化平稳，且酶活性较低。18 d后蔗糖酶活性逐渐增强，至培养24 d时，蔗糖酶活性仍保持上升趋势。麦芽糖酶活性自细胞培养16 d时逐渐增强，培养24 d后仍保持上升趨势。蔗糖酶和麦芽糖酶活性在20～22 d之间均变化平稳，故细胞培养21 d用于儿茶素EGCG对此两种酶活性的抑制试验。

2.3 儿茶素EGCG对Caco-2细胞上蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制作用

从图4可以看出，儿茶素EGCG对Caco-2细胞上蔗糖酶和麦芽糖酶均有抑制效果，且抑制作用随浓度的增大而增强。当EGCG浓度超过一定范围后对蔗糖酶和麦芽糖酶抑制活性的增强都减弱。EGCG对蔗糖酶和麦芽糖酶抑制IC50分别为31.08 μg/mL和36.44 μg/mL。EGCG对蔗糖酶的抑制效果要略强于麦芽糖酶。然而，在低浓度（10 μmol/L）情况下，儿茶素EGCG对麦芽糖酶抑制率高于蔗糖酶。

3 小结与讨论

α-葡萄糖苷酶是一类能够催化水解葡萄糖基的酶的总称。α-葡萄糖苷酶抑制剂可抑制小肠内α-葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道的吸收，从而有效降低餐后高血糖。中国人饮食结构主要是淀粉，麦芽糖酶和蔗糖酶在食物消化成可被吸收的单糖过程中发挥主要作用。Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞，体外培养时能自发地进行类似肠道细胞的形态学和生化学上的分化，获得许多小肠吸收细胞的特性。Caco-2细胞不同培养天数后蔗糖酶和麦芽糖酶活性检测结果表明，培养18 d后具有该细胞较高的蔗糖酶和麦芽糖酶活性，可用于研究药物对Caco-2细胞来源的蔗糖酶和麦芽糖酶活性的研究。Caco-2细胞孵育麦芽糖较孵育蔗糖时酶解产物葡萄糖含量高，说明Caco-2细胞上麦芽糖酶活性高于蔗糖酶。儿茶素EGCG对Caco-2来源的两种α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，且抑制作用有剂量依赖性。Xu等[12]对多种儿茶素单体体外α-葡萄糖苷酶活性比较得出，EGCG具有最强α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制类型为混合型抑制。Kamiyama等[13]对儿茶素小肠来源α-葡萄糖苷酶抑制研究发现，EGCG对麦芽糖酶的抑制活性远强于抑制蔗糖酶的活性，其抑制IC50分别为16 μmol/L和 130 μmol/L。在本试验中EGCG抑制蔗糖酶活性略强于抑制麦芽糖酶活性。不同的结论与试验所用的α-葡萄糖苷酶来源有极大相关性。EGCG在浓度为10 μmol/L时对麦芽糖酶的抑制率即接近于40%。EGCG与蔗糖酶和麦芽糖酶的结合特性还有待进一步研究。

儿茶素因其生物利用度低，在实际应用中受到极大限制。小鼠口服儿茶素[3H]-EGCG 1 h后，胃部存留率为30.7%，小肠部位存留率40.6%，之后大部分儿茶素随粪便、尿液排出体外，血液中[3H]-EGCG含量在24 h时约2%[14]。人体空腹口服EGCG含量高达800 mg/mL时，约2 h血液中EGCG含量达到峰值，最高浓度仅为1.6 mg/mL[15]。可见口服儿茶素后，在体内主要作用部位为小肠细胞。药物在小肠部位降血糖机理涉及钠葡萄糖共转运载体（SGLT1）、葡萄糖协助扩散转运载体（GLUT2）、为SGLT1提供动力的Na+-K+-ATP酶及水解产生葡萄糖的α-葡萄糖苷酶。儿茶素抑制糖转运体和Na+-K+-ATP酶功效亦有相关报道[16-18]。然而，儿茶素在小肠的部位不同，降低糖吸收途径的抑制效果的贡献率，及多种途径间是否有协同作用仍有待研究。

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