乙肝表面抗体酶标定量方法的建立

【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2018）04-0019-02

到目前为止，乙肝仍然被认为是无法治愈的疾病【1]，而乙肝疫苗的免疫效果成效显著，控制乙肝感染预防比治疗更重要。降低乙肝携带率关键是降低乙肝高危人群的携带率，《慢性乙肝防治指南》[2]指出，要定量检测高危人群乙肝表面抗体含量，当含量低于10mIU/ml时，要加强免疫。

乙肝两对半定量测定的经典方法是放射免疫分析法，但由于其放射污染，试剂盒有效期不长等缺点，影响了它的发展。基层现行的检测方法常用的是酶标法，但均以检测阳性或阴性即定性为指标，并不知道确切的乙肝表面抗体含量，当抗体的量小于10mIU/ml时，尽管定性结果为阳性，其实已无对乙肝病毒抵抗的能力。

酶标技术由于其灵敏度高、特异性强、试剂有效期长、无污染等优点，已成为临床检验中的主导技术，近年由于技术进步，酶标板吸附能力均一性、重复性提高；有效期由原来的6个月增加到一年，为酶标定量方法的建立奠定了基础。酶标定量已报道的有甲胎蛋白、C125和黄曲霉毒素等。乙肝表面抗体在人体内产生的量有限，血清不用稀释或低倍稀释即可回到线性范围。选择一种适应基层、且被大家都熟悉易推广的技术来建立定量方法，用以指导乙肝疫苗的注射，改变过去乙肝表面抗体定性不定量，病人家属每年打疫苗过度注射，或定性为阳性，其实已无保护力的弊端，使高危人群始终处于乙肝疫苗的保护之中，为此确立了“乙肝表面抗体酶标定量检测方法的建立”为研究课题。

1 材料

1.1 标准品：购自北京市福瑞生物工程公司。

1.2 血清、血浆标本：来自本实验室、本市两大医院的空腹血清654份，其中包括10份血浆。

1.3 實验试剂：酶标试剂选自科华、新创、荣盛、万泰、潍坊3V公司。放免试剂购自北京福瑞生物工程公司。

1.4 实验仪器：美国宝特酶标仪EXL-800，洗板机美国宝特EXL-50。南京华东电子管厂生产的DG-3022国产酶标仪，上海原子核研究所日环仪器一厂生产的SN-695B型智能放免r测量仪，荷兰生产的50ul、100ul、200ul微量加样器。

2 方法和结果

2.1 挑选线性范围宽的试剂盒

首先用6个浓度的标准系列（0、5、10、20、40、160mIU/ml）做标本，用实验室常用的经中国药品生物制品检定所检定合格的1.3提供的5种试剂盒，按照试剂盒的说明书操作，以浓度的对数值为横坐标，以OD/Cottoff对数值为纵坐标，计算其相关系数。

根据表1可知，3V试剂灵敏度高，线性范围宽，（0-160mIU/ml），与放免试剂盒的线性范围一致，故以后的酶标实验全采用3V试剂。

2.2 酶免定量方法和放免方法的比较：用同样标本同时做酶免定量实验和放免试验，观察其结果的t值。

2.2.1 标本：标本选择了肝癌家族，父亲大三阳、小三阳、母亲小三阳的家属子女，家中、单位有乙肝病毒传染源，自然产生乙肝抗体，打疫苗产生乙肝抗体8种情况的乙肝表面抗体阳性者70份。

2.2.2 放射免疫实验：使用1.3提供的放免试剂盒，严格按试剂盒说明书操作。

2.2.3 酶标定量试验：用选择好的3V试剂做实验中的酶标试剂，实验方法进行改动，将原来定性实验中所加的两个阳性对照、两个阴性对照换成标准系列（0-160mIU/ml）6个孔，再加一个空白孔，其它操作均与原来定性方法相同。

结果计算同放射免疫法，以标准系列浓度值的对数值为横坐标，以OD/Cottoff的对数值为纵坐标，使用计算器fx-3600P进行log-log线性回归处理，样品的抗HBs含量用曲线查得，当样品的浓度大于160mIU/ml时，用生理盐水1：11稀释后再测，测量结果乘以稀释倍数即为该样品的浓度值。

2.2.4结果

2.2.4.1 统计分析：70份样本同时进行酶标定量和放免定量测定，其浓度值的均数经过t检验，t=0.4213，n=70，P>0.05，浓度值差异无统计学意义。相关系数r=0.6682，相关系数t检验t=7.4，P<0.001，证明酶标定量方法检测乙肝表面抗体同放免定量方法具有等效性，由此可知酶标定量检测乙肝抗体，其方法学能够成立。

2.2.4.2 精密度测定：用同一份标本进行17次批内变异系数的测定，CV批内=6.87%（n=17）；用另一份标本观察其批间变异系数，其CV=9.4%（n=16），均符合生物制品规定的要求（CV<15%）[3]。

2.2.4.3国产酶标仪和美国宝特酶标仪对检测结果的比较：用标准系列做酶标定量测定，国产酶标仪比色，其相关系数r=0.95，美国宝特酶标仪r=0.98，虽然国产酶标仪的相关系数小于美国宝特酶标仪，但已达到放免试剂盒技术参数的要求。19份实际检测的样本在实验最后分别用国产和进口酶标仪比色，浓度值进行t检验，t=1.594，P>0.05，结果差异无统计学意义，相关系数t检验p<0.001说明国产酶标仪定量检测乙肝表面抗体，可以替代美国宝特酶标仪。

2.2.4.4 血清和血浆结果的对比：用10个人的血清、血浆做酶免定量实验，所测出乙肝表面抗体浓度值做t的检验t=0.35，p>0.5，相关系数r=0.99，t=19.85，p<0.001，说明该方法血清、血浆都适用。

3 讨论

3.1 经过上述一系列实验，建立了酶标定量法检测乙肝表面抗体。该方法只需要购买一套标准系列，以浓度的对数值为横坐标，以OD/COttoff值的对数值为纵坐标，进行log-log回归处理，线性范围达0-160mIU/ml，相关系数r≥0.95，达到了放免定量试剂盒的技术要求。

3.2课题的创新点：

酶标定量法有诸多优点，它与放免法的比较见表2.

3.2.1 每批标本都带有标准品，抵消了由于试剂、人员、环境、仪器的差异造成的误差，起到了室内质控的作用，保证了定量试验的准确性。

3.2.2该方法的建立，填补了乙肝表面抗体酶标定量的空白，经中国医学科学院医学信息研究所查新：“未见与该研究项目创新点相同的国内文献报道”。

4 课题的推广应用：

根据李淑秋的研究[4]，乙肝表面抗体量在10—100mIU/ml者，能维持半年；101-500mIU/ml者能维持两年；500-1000mIU/ml者能维持三年；>1000mIU/ml者能维持三年以上的研究结论，来指导乙肝高危人群的疫苗免疫。

4.1 将酶标定量方法应用于日常门诊非肝炎病人203人乙肝表面抗体检测中发现，自然产生乙肝表面抗体阳性率为28%，与92年全国病毒性肝炎流行病学调查的山西省的情况非常接近[5]。

4.2 将酶标定量方法应用于单位有乙肝和家中有乙肝73人，发现一例被传染成小三阳，一例乙肝三个抗体全阳性的事例。

4.3将酶标定量方法应用于肝癌家族16人，尽管例数较少，但发现在服侍病人过程中传染乙肝的事例。

4.4将酶标定量方法应用于父亲大三阳、小三阳、母 亲小三阳的家属子女57人的乙肝抗体监测中。发现了父系传播，有两种情况，一种是父得病在前，孩子出生在后；一种是孩子出生在前，父亲得病在后。还发现母婴传播给双胞胎的现象。

4.5 将酶标定量方法应用于乙肝疫苗免疫305人，发现一些人全程免疫两次都不产生抗体；全程免疫一次产生抗体低等因人而异的不同的免疫结果。

5 有待继续研究的问题

5.1能否用一支质控品代替标准系列，在做好曲线的基础上，每天带一次，以质控图为依据。只要质控品在控，就认为实验有效，同每天带标准品，比较其所测浓度的差异性。

5.2在酶标定量方法的应用中，观察自然产生乙肝抗体和疫苗产生抗体量的差异，在体内维持时间的差异。

参考文献

[1]《中国成人乙型肝炎免疫预防技术指南》中华流行病学杂志，2011；32 （12）：1199-1203.

[2]《慢性乙肝防治指南》2005年.

[3]北京药品生物制品檢定所，医学生物制品学，人民卫生出版社.北京：1995：1007-1021.

[4]李淑秋，石桂荣，等.接种乙肝疫苗后抗-HBS最高滴度与保护水平持久性的关系探讨.中华流行病学杂志，1992；13（3）：134-138.

[5]《中国病毒性肝炎血清流行病学调查》，（1992-1995年）.

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