纤维素酶水解小麦秸秆的酶解动力学

摘要：小麦秸秆粉末经过2%稀NaOH溶液蒸煮预处理后，投入纤维素酶进行水解反应，对水解反应条件进行了优化后显示：小麦秸秆悬浮溶液与纤维素酶混合反应30 h后检测还原糖含量，当投入纤维素酶量40 U/g，温度45 ℃，磷酸盐缓冲液调节pH值为4.5，小麦秸秆酶解效率最高，达到64.3%;同时试验证明NaCl和MgSO4对反应有促进作用;纤维素酶水解小麦秸秆的米氏常数Km和最大反应速度vmax分别为1.175 mg/L和0.221 mg/（h·L）。

关键词：小麦秸秆;预处理;纤维素酶;还原糖

中图分类号： TQ914.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）02-0309-03

我国是世界上秸秆产量最大的国家，年产量近7亿t，其中小麦秸秆占总秸秆数量的一半以上[1]。伴随粮食丰收之后的大量秸秆的处理一直是每年都要面临的重要议题，而传统的焚烧处理不仅造成了资源的浪费，更是对环境造成了严重污染[2]。秸秆作为一种可再生资源，对它合理利用将会产生巨大的经济效益和环境效益，具有重大的开发和研究价值，近年来经过研究人员不断探索，已经开发出饲料添加、造纸原料、无机肥原料、生物发酵等处理方法[3-4]，这些方法开发了秸秆利用的新途径，但是因为应用面狭窄、产值不高等问题，造成只能开发局部而不能普及于广大小麦产区。

近年来随着酶工程的快速发展，纤维素酶已经能够工业化大量生产，这为小麦秸秆的深层次开发提供了一种重要工具。纤维素酶作为一种复合酶，能够将小麦秸秆中的主要成分纤维素水解为还原糖[5]。通过水解反应，1 t纤维素完全水解后可生产1.1 t葡萄糖，而糖作为一种基础生物化工原料，广泛应用于发酵、有机合成、食品添加、饲料添加等行业，是一种高附加值的原料。通过纤维素酶催化水解小麦秸秆，具有条件温和、反应高效、产物价值高等特点，证明该生物转化方法是一种环保经济的处理方法，具有广阔的应用前景[6]。

未经处理的小麦秸秆中纤维素的含量约为39.31%，经过一定处理后，能够提高纤维素的相对含量达到50%以上[7]。使用稀碱溶液蒸煮粉碎的秸秆，能够有效地破坏木质素和半纤维素等物质对纤维素的保护作用，并且对纤维素结晶也具有疏松作用，处理后增大了纤维素与酶的接触面积，更加有利于反应效率的提高。本试验将预处理的纤维素作为底物与纤维素酶混合进行反应，通过检测还原糖的含量来监测反应的进行程度，并且对反應条件进行初步优化，进一步提高了纤维素酶的水解效率[8]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂材料 纤维素酶由龙科特酶制剂工程有限公司生产，为棕黄色液体。小麦秸秆产自山东省沂水县附近农村，NaOH、磷酸盐、盐酸以及其他实验室常用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器设备

SHA-C恒温振荡器（常州电器有限公司），721可见光分光光度计（上海菁华科技仪器公司）。

1.3 方法

1.3.1 秸秆预处理 称取1 kg正常晒干的秸秆磨粉后过100目筛，称取100 g秸秆粉末浸入250 mL 1.5% NaOH溶液中，加热煮沸处理30 min，冷却至室温后盐酸调节至中性，3 000 r/min 离心清洗3次，沉淀烘干备用。

根据纤维素的水解化学式：（C6H10O5）n+nH2O→nC6H12O6 得出：

秸秆中纤维素含量=（还原糖质量×0.909）/秸秆质量×100%。

1.3.2 纤维素水解反应 准确称取4 g纤维素粉末，煮沸浸泡30 min冷却后与100 U纤维素酶溶液混合定容至100 mL。反应温度通过恒温水浴摇床控制在40 ℃，pH值通过磷酸缓冲盐调节为5.0。每4 h取样1次，检测还原糖含量。

1.3.3 还原糖和酶活的测定 采用DNS法[9]检测糖含量。由于纤维素酶为复合酶，难以统一检测酶活，所以本试验采用最后产物还原糖的糖化率来表示酶活力。同时为了更清晰地作出对比，将同一时间点的最高酶活力作为100%参照，采用相对酶活力表示。

糖化率=（还原糖质量×0.909）/添加秸秆中纤维素质量×100%[10]。

2 结果与分析

2.1 添加酶量对反应的影响

在同一条件下，分别添加10、20、30、40、50、60、70、80 U酶量，10 h后检测还原糖含量。由图1可知，随着添加酶量的增加，相同时间段内还原糖的产量有不同幅度增加，当酶量为40 U后继续增大酶添加量，还原糖产量增加缓慢，增加至 60 U 后几乎不再增大产率，说明在该条件下，酶含量已经趋近饱和。为了避免造成酶的浪费，节省开支，同时达到最大的生产效率，40 U单位酶量是最佳添加量。

2.2 纤维素酶水解小麦秸秆反应进程

纤维素酶与小麦秸秆悬浮液混合反应，每隔4 h取样检测还原糖含量。结果表明：反应92 h后，还原糖含量不再发生明显变化，认为在该条件下，小麦秸秆中的纤维素反应完全，糖化率为100%，继续反应至102 h后，检测还原糖的产量为2.173 g，根据纤维素和还原糖的反应比例关系，该反应完全水解了1.975 g纤维素， 则本批次预处理小麦秸秆粉末的纤维素含量为49.4%。由图2可知，在40 h前反应速度较为恒定，可以看做零级反应，所以选择40 h前的时间段作为酶动力学检测时间，为了减小误差，选择30 h作为反应检测终点[11]。

2.3 温度和pH值对纤维素酶水解秸秆纤维的影响

在温度20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃梯度，检测不同温度对纤维素酶水解小麦秸秆纤维活性的影响。反应30 h后检测产物还原糖含量，结果（图3-a）显示，随着温度的升高，还原糖的含量不断升高，反应温度为45 ℃时酶活最高，温度继续升高酶活降低，反应温度提高至60 ℃以后，酶活降低至50%以下，已经不能达到反应要求的效率。本次使用的纤维素酶，在自然pH值条件下，常温条件储存3 d后酶活力仍然保持84%，在4 ℃低温条件下储存10 d，酶活力保持80%以上，说明该酶的温度稳定性较高，不易失活。

在最适温度45 ℃条件下，选择pH值3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0梯度，反应30 h后检测还原糖含量，结果显示，在较低pH值范围内酶活较低，随着pH值的升高，酶活逐渐增大，在pH值4～6.5范围内酶活保持70%以上，在pH值为4.5时，酶活达到最大，之后酶活开始逐渐降低（图3-b），说明该纤维素复合酶为偏酸性酶，同时最佳反应pH值为4.5。该酶在室温pH值3～6的条件下储存5 d，酶活力保持在80%以上，在碱性条件下保存2 d，酶活损失60%，恢复最适pH值后不能恢复酶活，证明酶在碱性条件下易变性失活。

2.4 金属离子对纤维素酶水解秸秆纤维的影响

本试验对各类金属离子不同浓度对纤维素酶水解小麦秸秆的影响进行了对比。以不添加金属离子的反应作为100%对照，结果如表1所示。Na+和Mg2+不同的浓度对纤维素酶水解小麦秸秆都有促进作用，5 mmol/L时促进作用最明显，Cu2+对酶活有抑制作用，这是由于重金属离子使蛋白质变性失活，抑制了反应的进行[12]。试验数据显示，试验中其他金属离子对酶活影响较小。

2.5 纤维素酶动力学

在上述最优条件下，测定不同底物浓度下的反应初速率，分别以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，反应初速率的倒数1/v 为纵坐标作图，得反应初速率与底物浓度的Lineweaver-Burk双倒数拟合曲线[13]。由图4可知，纤维素酶水解小麦秸秆的米氏常数Km和vmax分别为1.175 mg/L和 0.221 mg/（h·L）。

3 结论与讨论

本次试验中，小麦秸秆经过稀碱蒸煮预处理后，能够被纤维素酶完全水解的纤维素含量为49.4%，仍然有大量木质素或结晶状态的纤维素存在，影响纤维素的糖化率[14]。经过条件优化，本次采用的纤维素酶水解小麦秸秆生产还原糖的最佳反应条件为温度45 ℃、pH值4.5，而且该酸性纤维素酶具有较好的热穩定性和酸碱稳定性，反应进行中适量的Na+和Mg2+会促进反应的进行，而重金属离子使纤维素酶失活，抑制反应进行。本试验各项条件优化结果为酶水解小麦秸秆提供了应用基础。

后续工作中，需要继续进行小麦秸秆的预处理进行优化，提高纤维素的相对含量，充分破坏纤维素的结晶结构，有利于秸秆中纤维素与纤维素酶的充分接触反应。

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