液相色谱-质谱联用-定向进化酶组合技术应用于三萜类皂苷转化研究

评价重组酶的作用。

关键词 三萜皂苷; 生物转化; 液相色谱-质谱联用; 酶定向进化技术

1 引 言

三萜皂苷是自然界中广泛存在的一类重要的植物次生代谢产物，是由三萜皂苷元和糖以及其它有机质组成，存在于许多中药（如威灵仙、三七、柴胡、商路）中，具有广泛的药理活性，如抗癌、抗炎、抗糖尿病、提高免疫力等生物学活性，目前，已从自然界发现2万余种类型，常见的三萜皂苷主要包括四环三萜皂苷和五环三萜皂苷两大类。四环三萜可分为羊毛脂烷型、达玛烷型、葫芦素烷型、原萜烷型、环菠萝蜜烷型等;五环三萜可分为齐墩果烷型、乌苏烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型等。其中，达玛烷型四环三萜和齐墩果酸型五环三萜是最为常见的两种三萜类皂苷，因而对这两类皂苷的研究也是目前的热点[1～7]。商陆皂苷甲和柴胡皂苷A均为齐墩果酸型五环三萜，前者是在其皂苷元基础上C-3位糖侧链由一分子木糖和一分子葡萄糖以β-（1，4）糖苷键连接而成，后者为其皂苷元上的C-3位糖侧链由一分子岩藻糖和一分子葡萄糖以β-（1，3）糖苷键组成;三七皂苷R1为达玛烷型四环三萜，在C-20位连接一个葡萄糖，C-3位糖侧链由一分子木糖和一分子葡萄糖组成，其连接方式以β-（1，2）糖苷键连接。以上3种三萜皂苷具有重要的药理活性，如商陆皂苷甲具有保护肝脏的作用， 柴胡皂苷A具有抑制病毒的活性， 三七皂苷R1对糖尿病具有治疗等作用[8～10]。

三萜皂苷化学结构的差异使其在生物利用度及生物活性等方面存在较大差别。如苷的极性与它所连接的糖基数量成正比，因而苷的极性比其次生苷或苷元的极性大，对应脂溶性相对较低，从而不利于吸收[11]。近期的研究还表明，三萜皂苷去糖基化后的代谢或转化产物表现出了更好的生物可吸收性及药理活性。如在治疗冠脉结扎导致的大鼠心肌缺血方面，三七皂苷R2的药效活性比三七皂苷R1高[12]，三七皂苷R2与三七皂苷R1具有相同的皂苷元结构，其结构差别在于C-20位连接葡萄糖残基数量的不同，三七皂苷R1的C-20位连接一个葡萄糖， 而三七皂苷R2的C-20位无糖基取代，推测糖基的数量不同导致其药理活性的差异;商陆皂苷甲是商路的主要活性成分，因其具有显著的抗炎活性而得到越来越多的重视，然而商路皂苷甲的强溶血性极大地限制了其应用。通过生物转化方法对商路皂苷甲进行去糖基化处理后， 生成的商路皂苷乙不仅溶血性降低，抗炎活性也得到进一步增强[13，14]。因而，通过三萜皂苷的去糖基化结构修饰有望获得药效更加显著、安全低毒的皂苷化合物。

去糖基化可通过热转化、温和酸水解、酶水解、微生物转化法等方法实现，其中，微生物转化和酶水解因其具有较高的底物特异性及低副产物和高产率的特性而被广范应用[15]。于蓓蓓等[16]报道了在肠道微生物作用下柴胡皂苷A转化为柴胡次皂苷F，柴胡次皂苷F又进一步被转化为柴胡皂苷元F。Cui等[17]报道了应用葡萄糖苷酶将商路皂苷甲转化为商路皂苷乙。本研究组之前报道了利用重组内切纤维素酶Fpendo5A转化三七总皂苷并获得去糖基化皂苷化合物的研究[18]。到目前为止，能用于商路皂苷、柴胡皂苷及三七皂苷转化的微生物及酶的数量仍然较少，极大地限制了其理论研究及应用开发，因此，开发可用于转化商陆皂苷、柴胡皂苷、三七皂苷的新型酶，从而获得高效、稳定、低毒的活性皂苷具有重要意义。

重组糖苷酶ABQ来源于Flavobacterium johnsoniae菌， 在65℃、 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH=5.0）的条件下，具有很好的活性，此酶反应条件温和，适用于皂苷转化的研究。本研究利用重组糖苷酶ABQ对商陆皂苷甲、柴胡皂苷A和三七皂苷R1进行转化，应用高效液相色谱仪和快速分离液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪对3种三萜皂苷的转化产物结构进行鉴定，从而阐明其转化机制。 本研究结果将有助于三萜皂苷生物转化工艺的开发，同时为三萜皂苷的药理研究及开发奠定基础。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

ThermoU-3000型高效液相色谱仪、NanoDrop2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）; Agilent RRLC 1200 SL-6520 Q-TOF-MS液相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）; 5811GK981477台式大容量高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）; Medlum-S400超纯水机（上海和泰仪器有限公司）; MLS-3751L高压蒸汽灭菌器（日本Panasonic公司）。

柴胡皂苷A、商陆皂苷甲、三七皂苷R1的皂苷标品（纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）; 乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，美国Fisher试剂公司）; 对硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基 -β-D-吡喃半乳糖苷、对硝基苯基 -α-L-呋喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基 -α-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基 -α-L-吡喃鼠李糖苷、对硝基苯基 -β-D-吡喃木糖苷、邻硝基苯基 -β-D-吡喃葡萄糖苷、纤维二糖、龙胆二糖、昆布二糖、蔗糖（纯度98%，上海源叶生物科技有限公司）; 异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、Kanamycin Sulfate（纯度≥99%，北京金泰宏达生物科技有限公司）。

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