过度训练对大鼠肠道ｓＩｇＡ和血浆内毒素含量的影响以及谷氨酰胺的干预作用

（1.扬州大学体育学院，江苏 扬州 225009；2.南通航运职业技术学院， 江苏 南通 226010）

摘 要： 目的：探讨过度训练对肠道sIgA和血浆内毒素含量的影响及其谷氨酰胺的干预作用和 机制。方法：实验大鼠随机分为对照组、过度训练组、谷氨酰胺干预组。过度训练组大鼠进 行每周6次，共9周的力竭性运动训练。谷氨酰胺干预组大鼠在大负荷运动之前按1.5 g/kgBW 剂量补充谷氨酰胺。9周后，检测各组大鼠小肠sIgA、Gln、MDA的含量及SOD活性。结果：1)与对照组比较，过度训练组大鼠小肠sIgA含量显著下降；且小肠SOD活性、Gln含量显著下 降，MDA含量显著升高。2) 与过度训练组相比，Gln干预组小肠sIgA和Gln的含显著升高，虽 然SOD活性没有显著性变化，大鼠小肠组织中MDA含量显著降低。结论：1) 过度训练导致大 鼠肠道体液免疫功能显著下降；过度训练时大鼠肠道Gln水平下降和自由基代谢的增强，可 能是过度训练引起肠道免疫功能降低的主要机制。2) 补充Gln可改善长期大负荷运动训练大 鼠肠道体液免疫功能；而Gln的补充可使大负荷训练大鼠肠道Gln含量升高和氧自由基生成减 少，可能是Gln补充防止大负荷训练大鼠肠道体液免疫功能下降的主要机制。

关键词：过度训练；谷氨酰胺；肠道体液免疫；肠道sIgA；血浆内毒素

中图分类号：G804.32 文献标识码：A 文章编 号：1007-3612(2009)03-0057-04

Effect of Overtraining on Intestinal sIgA and Plasma Endotoxins Concentration inRats and Intervention of Glutamine Supplementation

JIN Qiguan WANG Haijun , LIU Li WANG Yongliang1

(1. Physical Education College, Yangzhou University, Yangzhou 2 25009, Jiangsu China;

2. Nantong Shipping College, Nantong 226010, Jiang su China)

Abstract: Objective: To explore the effect of overtraining on sIgA and plasma end otoxins concentration in rats and the intervention effect of glutamine and its m echanisms. Method: Experimental rats are randomly divided into control group, ov ertraining group and glutamine intervention group. The rats in overtraining grou p are carrying on exhaustive training for 9 weeks, 6 times/week. The rats in glu tamine intervention group is supplemented Gln with 1.5g /kgBW dosage before heav y training. 9 weeks later, intestinal sIgA, Gln, MDA content, SOD activity and p lasma endotoxins concentration are examined. Results: 1) Compared to the control group, in the overtraining group, intestinal sIgA content obviously decreases a nd plasma endotoxins concentration obviously increases. And intestinal SOD activ ity, Gln content obviously decreases, MDA content obviously increases. 2) Compar ed to the overtraining group, in the glutamine intervention group, intestine sIg A content increases significantly, plasma endotoxins concentration obviously red uces. Although intestinal SOD activity has no significant change, MDA content ob viously reduced. Conclusion: 1) Overtraining might cause intestinal humoral immu nity in rats to reduce obviously. The significant decrease of intestinal Gln con centration and increase of metabolism of free radical in rats with overtraining, might be main mechanism that overtraining causes intestinal humoral immunity to reduce. 2) Supplement of Gln can improve intestinal humoral immunity in rats wi th longterm heavy load training. Gln supplement might prevent the decrease of i ntestinal Gln content and reduce formation of free radical in rats with heavy lo ad training, it may be the main intervention mechanism which Gln supplement prev ented the decrease of intestinal humoral immunity.

Key words: overtraining; glutamine; intestinal humoral immunity; intesti nal sIgA; plasma endotoxins

大量研究已证实，肠道除了是消化和吸收的重要器官外，还是体内最大的免疫器官，肠粘膜 屏障功能损害是多器官功能不全综合症甚至多器官衰竭发生的始动因素。而肠道是谷氨酰胺 （Glutamine，Gln）利用的主要器官，Gln不仅是肠道能量的主要供体，而且还是许多其他 代谢途径的前体物质，特别是合成鸟氨酸、瓜氨酸、脯氨酸和精氨酸的前体物，对维持肠道 结构和免疫具有重要的调节作用。然而，过度训练，Gln和肠道体液免疫功能之间的关系目 前尚未见到研究报道。本研究通过对大鼠进行长期力竭性运动训练建立大鼠过度训练模型， 与此同时，在大鼠每天进行大运动量训练前，补充Gln，测定大鼠小肠中分泌型免疫球蛋白A （secretory immunoglobulin A，sIgA）、Gln、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量和 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性，以及血浆内毒素（endotoxins）含 量，以探讨过度训练对机体肠道体液免疫功能的影 响和Gln的干预作用及其机制，为进一步 研究运动性免疫抑制的机制及其干预措施提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组选用清洁级健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（购于扬州大学比较动物中心）31只，6周 龄，体重135～150 g，随机分为3组：对照组（Control，n=11），过度训练组（Heavy-load

training，HT，n=10）， Gln干预组（HT+Gln，n=10）。分笼饲养，每笼3～5只，饲养温度 (20±2)℃。光照时间12 h左右，标准混和饲料喂养，自由饮食。实验过程中由于灌胃操作 不当，导致第9周中Gln干预组大鼠死亡1只。

1.2 训练方案1) 对照组：不进行任何训练，每天补充同剂量的安慰剂（生理盐水）。

2) 过度训练组：大鼠过度训练模型的建立参照郑陆等人^[1]建立大鼠过度训练模型 时的训练 方案。即对大鼠进行9周持续性大运动量跑台训练（跑台坡度为10°），每周6次，周日休息 。第1周每天适应性训练10 m/min×30 min。第2至9周进行正式训练，每次从15 m/min开始 ，每5 min速度增加5 m/min，直至40 m/min，保持此速度至力竭。力竭判断标准：连续给予 大鼠施加声、光、机械刺激后，大鼠不能跑动，下跑台后伏地喘息，暂时无逃避反应，同时 记录每只大鼠运动到力竭的总时间，算出其总平均值。为了不打乱大鼠的生物钟节律周期， 故运动训练时间选择在晚上进行。在训练过程中动态观察大鼠的精神状态、饮食情况和体重 （每周日称量）等指标的变化。

3) Gln干预组：训练方法同过度训练组，训练时间为过度训练组的平均值。在每周一至周六 下午，灌服用生理盐水新鲜配制的Gln溶液，补充剂量为1.5 g/kg体重，周日停灌。

1.3 实验取材

动物于末次运动训练后，禁食12 h，第二天晨依次按50 mg/kg的剂量腹腔注射2％的戊巴比 妥钠溶液麻醉大鼠，然后从腹主动脉取血5 mL注入肝素钠的无菌抗凝试管中，4℃，4 000 r /min，离心10 min后，无菌分离血浆保存于－40℃冰箱中，以备测血浆内毒素。

在大鼠小肠的近端空肠5 cm以下处取2 cm 长的空肠，4℃条件下，准确称量0.3 g肠组织， 剪碎 ，移入玻璃匀浆器，然后加入预冷的生理盐水至总体积3 mL，在冰浴中用玻璃匀浆器仔细研 磨，制备10％肠组织匀浆。将匀浆液低温离心（4℃，3 500 rpm）10 min，取上清液－40℃ 保存，以备测定sIgA、Gln、MDA含量和SOD活性。

1.4 指标的测定

sIgA采用放射免疫法测定，试剂盒购于北京北方生物技术研究所，测定仪器为中国科大中佳 公司自动放免仪。血浆内毒素的测定采用鲎试剂比色法，试剂盒购于上海西唐生物科技有限 公司。SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定，MDA采用硫代巴比妥酸法测定，Gln采用比色法测定， 肠组织蛋白采用考马氏亮兰法测定，SOD、MDA、Gln等试剂盒均购于南京建成生物研究所， 测试仪器为日本产的UV-2450型分光光度计，均严格按照试剂盒说明操作。

1.5 统计学分析使用SPSS13.0统计软件处理数据，结果用均数±标准差（X±S）表示，统计学 分析采用单因素方差分析和独立样本t检验，P≤0.05表示为显著性差异，P≤0.01表示 为极显著性差异。

2 结 果

2.1 训练不同时期大鼠体重的变化由表1可见，实验前各组大鼠的体重无显著性差异。实验进行5周后，HT组大鼠体重明显低于 C组（P＜0.05），第6～9周末HT组大鼠体重显著低于C组（P＜0.01）。与C组比较 ，Gln干预组第6、7周末大鼠体重非常显著低于C组（P＜0.01），第8、9周末大鼠体重 显著低于C组（P＜0.05）。从第7周开始虽然Gln干预组大鼠体重高于HT组，但无显著性 差异。

2.2 实验大鼠肠组织sIgA和血浆内毒素含量的变化由表2可见，与C组比较，HT组肠道sIgA含量均显著下降（P＜0.05），而血浆内毒素含 量显著升高（p＜0.01）；Gln干预组与C组相比，肠道sIgA和血浆内毒素含量没有显著 性差异，但与HT组相比，肠道sIgA均显著升高（P＜0.05），而血浆内毒素含量显著下 降（p＜0.01）。

著升高（p＜0.01）；与HT组相比，Gln干预组Gln含量显著升高（ p＜0.05），

sIgA是肠粘膜表面的主要抗体，是肠粘膜主要的免疫球蛋白，长期以来一直被认为是第一线 的免疫防御，对粘膜固有的和入侵的病原体具有抵抗作用，故有人称粘膜免疫为sIgA免疫。 sIgA可抑制肠道内的细菌粘附肠道粘膜表面，还可中和肠道内的毒素、酶和病毒，并结合抗 原形成免疫复合物由吞噬清除，直接作用于细菌表位，使已被肠道酶类改变的病原体毒力降 低，尤其对肠道菌群中的革兰阴性杆菌具有特殊的亲和力，能包被细菌、封闭细菌与肠上皮 细胞结合的特异部位，阻止其与肠上皮细胞的吸附，避免细菌穿透肠上皮发生移位，是阻止 细菌移位的重要环节^[2]。早在1982年Tomasi研究发现了越野滑雪运动员比赛后sIg A水平下降^[3]，其结果后又被Mackinnon等证实。Mackinnon（1994）发现，运动员 经2 h高 强度自行 车功率计运动后，sIgA水平下降70%，并且这种变化持续到运动结束后数小时，运动后24 h 才恢复正常^[4]。然而，运动训练对肠道sIgA 含量的影响目前研究很少。为了探讨 过度训练 对大鼠肠道体液免疫功能的影响，本研究参照郑陆等人建立大鼠过度训练模型时的训练方案 ，对大鼠进行9周持续性大运动量跑台训练，建立了大鼠过度训练模型。结果发现，过度训 练组大鼠小肠中sIgA含量显著降低，同时伴随着血浆内毒素含量的显著上升。

肠道是人体最大的细菌及内毒素贮存库，但在正常情况下，并不损害机体健康，这完全依赖 于机体完整的肠道粘膜屏障功能。肠道内细菌或其产物（内毒素）突破肠粘膜屏障进入肠系 膜淋巴结或门静脉系统，进一步到达远离肠道的其他器官，称肠道细菌易位（Bacterial Tr anslocation，BT）^[5～7]。研究表明，少量细菌、内毒素这种微小粒子在进入全 身循环前即 通过门静脉入肝脏，就很快被肝脏网状内皮系统所清除；即使这些微小粒子进入全身血循环 ，血清蛋白还可对之进行清除和解毒，其中如脂多糖结合蛋白、杀菌-通透性增加蛋白和高 密度脂蛋白等，均在此过程中起一定作用。只有当肠腔内细菌过度增长，或一旦肠道粘膜屏 障作用和清除作用受损，即可发生细菌和内毒素易位^[8]。因此，过度训练时，肠 道sIgA 合 成和分泌减少，中和肠腔中内毒素的能力降低，细菌与肠粘膜的粘附增加，从而引起细菌和 内毒素易位，导致血浆内毒素含量的升高。因此，过度训练引起肠道sIgA含量的显著降低和 血浆内毒素含量的显著升高，说明了过度训练可使大鼠肠道体液免疫功能显著下降。

3.2 Gln补充对大负荷训练大鼠肠道sIgA和血浆内毒素含量的影响

Gln 的补充与肠道免疫功能之间的关系，目前在临床上的研究很多。研究表明，在严重创伤 或外科手术等应激时，补充谷氨酰胺可以防止sIgA减少，阻止小肠黏膜中IgA浆细胞和淋巴 细胞的减少，增强肠道淋巴细胞的功能，从而维持小肠黏膜的免疫功能，预防感染或败血症 的发生。余斌等在烧伤香猪早期肠道营养液中加入Gln，测定肠道sIgA的含量，结果发现NON -Gln组空肠液中sIgA伤后明显降低，而Gln 组伤后无明显变化；回肠液中sIgA含量，NON-Gl n组伤后10 d明显降低，Gln组则无明显变化^[9]。Bartell等研究也发现，给小鸡喂 养1％的G ln，21 d后小鸡的小肠IgA含量明显升高，并且小肠绒毛长度更长^[10]。为了研究G ln的补充 对过度训练大鼠肠道体液免疫功能的干预作用，本研究在每次对大鼠进行力竭性运动训练前 ，按照1.5 g/kg体重的剂量补充Gln，结果发现，Gln干预组大鼠肠道sIgA 含量显著高于H T组，血浆内毒素含量显著低于HT组，但与对照组相比均无显著性差异。

刘铁民^[11]等通过对大鼠进行8周的大运动量的跑台训练，建立过度训练模型。结 果也发现 ，过度训练组大鼠肠粘膜结构明显损伤，主要表现为肠粘膜绒毛水肿增粗、高度缩短、长短 不一、排列紊乱，上皮细胞坏死脱落严重，固有层有一定程度水肿，伴有炎性细胞浸润，同 时肠粘膜固有层IgA浆细胞数量减少，粘液IgA含量显著降低。而补充Gln的过度训练组，肠 粘膜结构损伤的程度与过度训练组比较明显降低，肠粘膜固有层IgA浆细胞数量和粘液IgA含 量都显著高于过度训练组。因此，Gln的补充对过度训练状态下肠道免疫屏障结构和功能具 有显著保护作用，可以有效地防止大负荷训练大鼠肠道体液免疫功能的下降，对预防过度训 练的发生具有非常重要的作用。

3.3 过度训练影响肠道sIgA和血浆内毒素含量及其Gln的干预机制

研究表明，Gln是蛋白质、核酸等合成的前体，是细胞快速生长的主要能源。Gln不仅能预防 创伤、感染等应激状态和长期肠外营养（TPN）所致的肠黏膜萎缩，而且能够促进蛋白质合 成，改善氮平衡^[12]。邓高月等研究也发现，Gln强化的TPN能够有效防止5-氟尿嘧 啶化疗所 引起的大鼠体重的降低^[13]。本研究发现长期大负荷的运动训练可以导致大鼠体 重显著降 低，在训练过程中补充Gln虽然在一定程度上具有抑制大负荷训练大鼠体重降低的趋势，但 与HT组相比无显著性差异。

然而Gln作为一种重要的能量和原料（谷氨酸、氨）的来源在维持肠道免疫系统的正常功能 上有着非常重要的作用。目前认为，Gln是胃肠道上皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞重要的代 谢能量来源，在病理状态下谷氨酰胺是维持肠道黏膜代谢、结构及功能的必需营养成份。此 外，Gln作为核酸生物合成的前体和主要能源，可促使淋巴细胞、巨噬细胞分裂和分化增殖 ，增加细胞因子肿瘤坏死因子、白细胞介素 1 等的产生和磷脂mRNA的合成，具有重要的免 疫调节作用^[14]。Burke等研究发现Gln可能在细胞转换为IgA+B细胞，再分化成IgA +浆细胞 的过程中提供能源或蛋白质合成原料，也可能支持T细胞产生细胞因子^[15]。Gln缺 乏或利用 率下降会降低肠上皮细胞的增生而影响肠道功能；缺乏 Gln的肠内营养，可引起肠道相关的 淋巴组织萎缩，集合淋巴小结内T和 B淋巴细胞明显减少；在固有层内，IL-4和 IL-10的 mR NA的减少伴随着全肠道组织内IL-4和 IL-10的减少。补充Gln可显著降低肠黏膜的通透性、 维护肠道黏膜结构，增强肠道免疫功能，减少细菌易位，避免肠源性败血症的发生^{[14 ]}。

为了探讨过度训练Gln和肠道sIgA 之间的关系，本研究在测定大鼠肠道中sIgA含量的同时 测定了大鼠肠道Gln含量。结果发现，过度训练在大鼠肠道sIgA含量显著下降的同时伴随着G ln含量的显著降低，而Gln干预组肠道Gln含量显著升高的同时伴随着sIgA 含量的显著上升 。从而说明，过度训练导致肠道Gln含量的显著降低可能是引起肠道sIgA下降的重要机制， 而Gln的补充有效防止大负荷训练大鼠肠道Gln含量的降低，可能是Gln干预大负荷训练大鼠 肠道免疫功能的重要机制。

研究表明，Gln一方面可以通过对免疫细胞的直接作用发挥它的免疫效应；另一方面它也可 能通过维持肠道屏障功能或保护抗氧化剂谷胱甘肽来发挥它的间接效应^[16]。Gln 的补充不 仅能氧化分解为免疫细胞提供能量，而且能为免疫细胞的快速增殖提供合成DNA、RNA的前体 物质。同时，由于Gln是合成体内极其重要的抗氧化剂谷胱甘肽的重要物质，能增强机体的 抗氧化能力^[17，18]。

为了探讨大负荷训练时肠道自由基的生成、免疫功能和Gln之间的关系，本研究通过对大鼠 进行9周，每周6次的力竭跑台训练，建立了大鼠过度训练模型。结果发现，与对照组相比， 过度训练组大鼠肠道内MDA含量显著增加，SOD活性显著下降，表明过度运动可使肠道清除自 由基的能力下降，氧自由基生成增加。自由基的存在，一方面使膜性脂质双层发生脂质过氧 化反应，脂质双分子层的生理性稳态和膜表面的糖蛋白含量发生改变；另一方面，自由基可 使膜内蛋白质分子发生链式聚合反应，使ATP酶、碱性磷酸酶（AKP）和核苷酸酶的结构损伤 ，ATP生成减少，膜的主动运输能力下降^[19，20]。这些变化可能导致肠道粘膜上 皮细胞和T、B淋巴细胞水肿，最终导致细胞代谢紊乱和功能下降，发生凋亡，甚至死亡^[21，22]， 从而导致肠道sIgA生成减少。与此同时，本研究还发现，Gln干预组大鼠肠道SOD活性虽无显 著性升高，但MDA含量显著低于过度训练组（P＜0.05），表明补充Gln对长期大负荷训 练状 态下大鼠肠道自由基代谢有显著调节作用。因此，在大负荷训练前补充外源性Gln可能有助 于维持肠道Gln含量，增加机体的抗氧化能力，有效预防免疫组织的氧化性损伤和淋巴细胞 凋亡的发生，这可能是Gln改善大负荷训练引起的肠道免疫功能抑制的机制之一。

4 结 论

1) 过度训练时大鼠肠道体液免疫功能显著降低，主要表现为大鼠肠道sIgA水平降低和血 浆内毒素含量的显著升高。而过度训练大鼠小肠Gln含量下降和氧自由基生成增多，可能是 过度训练引起肠道体液免疫功能降低的主要机制。2) 在大鼠每次进行力竭性训练之前补充外源性的Gln，可使大鼠小肠内sIgA含量显著升高 ，而血浆内毒素含量显著降低，从而说明补充外源性Gln可以有效地防止长期大负荷运动训 练大鼠肠道体液免疫功能的降低。而Gln的补充可使大负荷训练大鼠小肠内Gln含量升高和氧 自由基生成减少，可能也是Gln补充防止大负荷训练大鼠肠道体液免疫功能下降的主要机制 。

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