空肠弯曲菌flaA基因序列及功能预测分析

摘要[目的]对空肠弯曲菌空肠弯曲菌flaA基因的序列及功能进行预测分析。[方法]分析了多个空肠弯曲菌flaA核酸及氨基酸序列组成和序列差异性;预测分析了flaA基因密码子使用偏好性、蛋白结构和功能域、FlaA与相关功能蛋白的互作情况。

[结果]不同菌株的flaA基因序列存在差异性，且差异主要存在于序列的中间区域。不同空肠弯曲菌菌株的同一基因在密码子选择上存在差异。FlaA与多个蛋白存在不同形式的相互作用。[结论]该研究可为空肠弯曲菌flaA基因序列分析和功能研究应用提供基础和依据。

关键词空肠弯曲菌;flaA基因;密码子偏好;蛋白结构域;蛋白互作

中图分类号S188文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）32-0156-05

Analysis of Gene Sequence and Function Prediction of flaA in Campylobacter jejuni

ZI Chen1，2，ZENG Dexin1，JIANG Luyan1 et al（1.APFIC，Jiangsu EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing，Jiangsu 210019;2.College of Veterinary Medicine，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095）

Abstract[Objective] To analyze and predict gene sequence and function of flaA in Campylobacter jejuni.[Method] The composition and variation of multiple nucleotide sequences and amino acid sequences of flaA were analyzed.The analyses of codon preference，protein structure and function domains，and proteinprotein interactions were performed.[Result]Gene sequence of flaA of different strains existed difference，the difference mainly existed in the intermediate region of the sequence.There were differences in codon choice on the same gene of different C.jejuni strains.FlaA interacted with multiple proteins in different forms.[Conclusion]The study provides the basis and foundation for the flaA gene analysis and function research of C.jejuni.

Key wordsCampylobacter jejuni;flaA gene; Codon preference; Protein domain; Protein interaction

基金项目訾臣（1985—），男，山东临沂人，博士，从事食源性微生物致病机制研究。

作者简介国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2016IK131）;江苏省出入境检验检疫局科研项目（2017KJ46）;南京农业大学科研资助项目（804121）;质检公益性行业科研专项（201510038）。

收稿日期2017-09-08

空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，CJ）属于螺旋菌科弯曲菌属，为革兰染色阴性菌，是世界范围内食物源性胃肠炎的主要病原菌之一，该病原菌主要通过禽肉等肉类食物传播[1]。空肠弯曲菌的致病机制中会有许多毒力因子的参与，其中鞭毛蛋白是其在动物肠道黏附和定殖的重要功能结构[2]。鞭毛蛋白由2个基因组成，即flaA 和flaB，研究發现flaA基因与空肠弯曲菌侵袭功能有关[3]。该研究通过分析多个flaA基因和氨基酸组成特点，预测flaA基因密码子偏好性特点、亚细胞定位、蛋白结构和功能域、互作蛋白等，为空肠弯曲菌的flaA遗传分化和功能研究提供依据。

1材料与方法

1.1flaA基因序列遗传差异分析

通过数据库获得多个菌株完整的flaA基因cds序列，比对分析各菌株核酸序列组成及遗传信息差异情况。

1.2flaA基因密码子偏好分析

利用CodonW在线程序[4]分析空肠弯曲菌flaA基因碱基组成、密码子使用偏好性。

1.3FlaA亚细胞定位分析

基于SVM分类方法，CELLO软件基于氨基酸的生理生化特性使用氨基酸组成（the amino acid composition）、二肽成分（the dipeptide composition）、分段氨基酸组成（the partitioned amino acid composition）、序列组成（the sequence composition） 等4种序列编码策略对FlaA进行亚细胞定位分析[5]。

1.4FlaA蛋白修饰位点及功能域分析

利用在线软件Motif Scan（http：//hits.isbsib.ch/cgi-bin/PFSCAN）预测NCTC 11168和D2640菌株FlaA蛋白序列修饰位点及结构域情况。

1.5FlaA互作蛋白预测分析

通过在线软件STRING（https：//stringdb.org/）预测与空肠弯曲菌FlaA存在相互作用的蛋白，并分析相应蛋白的功能特点。

2结果与分析

2.1空肠弯曲菌flaA基因序列遗传差异将空肠弯曲菌NCTC 11168菌株的flaA基因序列与NCBI核酸序列数据库进行Blast，结果获得空肠弯曲菌flaA基因相关序列共49个，对其进行核酸序列与氨基酸序列进化树分析，结果见图1、2。与NCTC 11168相比核酸序列遗传差异最大的是ICDCCJ07001、

图1空肠弯曲菌flaA基因核酸序列进化树

Fig.1The evolutionary tree of flaA nucleotide sequences of Campylobacter jejuni

RM3196和RM3197（后三者序列完全一致），遗传距离为0.226，其次为F38011，遗传距离为0.222，D2640排第4位，为0.214;与NCTC 11168相比氨基酸序列遗传差异最大的是D2640，遗传距离为0.199，其次为CDCCJ07001、RM3196和RM3197，遗传距离为 0.198。

利用Blast比对软件对所有氨基酸序列比对分析，发现氨基酸序列差异主要位于序列中部区域（180 ～ 480 aa），结果见图3。

2.2flaA基因密码子偏好性

通过氨基酸序列的进化树分析可知NCTC 11168和D2677菌株遗传差异最大。根据Codon Usage Database数据库可知空肠弯曲菌NCTC 11168菌株的密码子使用情况，编码序列中GC含量为30.83%，密码子第1位碱基GC比例为42.70%，第2、3位分别为30.44%和19.35%。该研究所分析的NCTC 11168和D2640菌株的flaA编码序列GC比例分别为37.00%、35.24%，均高于基因组水平（表1）;flaA基因密码子第1、2位GC含量均高于基因组水平，尤其是第2位GC含量接近甚至超过第1位的

比例，分别为44.71%、46.02%，该基因碱基成分比例與空

肠弯曲菌基因组水平的碱基使用存在差异。

进一步的密码子偏好性分析发现，NCTC 11168和D2640的flaA基因分别对25和24种密码子具有偏好性（RSCU>1），存在偏好性差异的密码子为ATT、ATC、GTA、CCA，其中D2640编码脯氨酸（CCA-Pro），而NCTC 11168不编码该氨基酸。flaA基因密码子第3位偏好使用T，几乎所有同一密码子中，均为T3的比例最高，除了NCTC 11168菌株的异亮氨基酸（Ile）偏好使用ATC而不是ATT（表2）。Codon Usage Database数据库中5个空肠弯曲菌株全基因组水平Ile氨基酸的密码子偏好顺序均依次为ATT、ATA、ATC，分析结果显示，D2640菌株flaA编码Ile氨基酸的密码子偏好性与全基因组水平相同，而NCTC 11168依次为ATC、ATA、ATT，偏好使用ATC编码Ile氨基酸，说明不同菌株的flaA对Ile氨基酸编码存在密码子偏好性差异。

2.3FlaA亚细胞定位

NCTC 11168菌株FlaA蛋白亚细胞定位预测结果：内膜（inner membrane） （0.056），外膜（outer membrane） （1.196），周质（periplasmic） （0.075），胞外（extracellular） （3.654），胞质（cytoplasmic） （0.019），胞外和外膜定位的预测值为3.654和1.196，且达到显著水平。预测结果说明该蛋白为分泌表达的外膜结构成分，结果与鞭毛蛋白结构及亚细胞定位特征一致。

2.4FlaA氨基酸修饰位点和功能域

在2个菌株中预测到可能发挥糖基化的天冬酰胺位点数分别为7和13个，CK2磷酸化位点数分别为8和9个，PKC磷酸化位点数分别为12和10个，烷基化位点数分别为23和26个。NCTC 11168菌株FlaA 的395～457区域有21个丝氨酸残基，为丝氨酸富集区域;D2640菌株在398～641区域有21个丝氨酸残基;二者的丝氨酸富集程度高度相似，而两者在丝氨酸富集区域其他氨基酸组成差异较大，处于遗传差异区域，说明此处富集的丝氨酸在FlaA蛋白功能中具有重要作用。二者具有相同的Flagellin N、Flagellin IN、Flagellin C结构域。Flagellin N和Flagellin C结构域为两端保守区域，Flagellin IN所处的中间区域保守性相对较低（图4和表3）。

2.5FlaA蛋白互作及功能分析

测到空肠弯曲菌FlaA与FliS等10个蛋白存在互相作用（图5），其中参与鞭毛组分的蛋白有FliS、FlgE2、FliD、FlgE、FlgK、FlhA、FlaG等，Cj1340c是一种运动辅助因子（Motility accessory factor），FliA是鞭毛操纵子的RNA聚合酶σ因子，PseE参与蛋白的糖基化修饰。互作形式主要有邻近作用、融合作用、基因共现等，其中与FliS、PseE、FliD、FlhA、Cj1340C等互作已有相关试验验证。

3讨论

研究发现通过修复flaA和flaB突变体中的FlaA功能，鞭毛结构、菌体运动力、定殖和侵入以及毒力蛋白分泌等功能都得以恢复，可见鞭毛蛋白基因flaA在空肠弯曲菌肠道致病过程中的重要作用[6]。对其基因序列及相关功能域等进行分析，有利于对其相关功能的研究。该研究结合数据库中的序列信息资源，分析多条空肠弯曲菌flaA基因核酸和氨基酸序列组成情况及保守性，结果发现不同菌株的flaA基因序列存在差异性，且差异主要存在于序列的中间区域。

基因编码信息遵循“中心法则”：由DNA序列转录为mRNA序列，并最终翻译成氨基酸序列。每3个核酸组成1个密码子并决定1个氨基酸，每个氨基酸可对多个密码子，而特定物种或某些基因的特定位点氨基酸对某种密码子的使用存在偏好性[7]。空肠弯曲菌flaA基因序列中GC含量高于基因组水平，说明相对于全基因组水平flaA主要偏好使用含G/C的密码子，而且flaA基因密码子第1和第2位GC含量均高于基因组水平，第3位偏好使用T。NCTC 11168和D2640的flaA基因存在4个偏好性差异的密码子，说明不同空肠弯曲菌菌株的同一基因在密码子选择上存在差异。对碱基组成和密码子偏好性进行分析，有助于构建优化的基因外源表达模型。

氨基酸发生糖基化/磷酸化/烷基化等修饰会影响蛋白质的空间结构形成和功能发挥。分析结果显示flaA基因存在多个修饰和功能位点，说明其在合成及功能形成过程中可能受多种形式的氨基酸位点修饰，在其发挥特定功能中至关重要。很多蛋白质不是独立发挥作用，而需要通过与其他结构蛋白或者功能蛋白直接或间接作用，或形成蛋白质复合物在某些生物过程中发挥相应的生物学功能。鞭毛由多种结构蛋白组成，在其组成和发挥功能的过程中有其他多种功能蛋白的参与，因此对FlaA互作蛋白的预测分析有利于揭示鞭毛的组成情况，有助于其功能机制的研究。蛋白互作分析结果显示，FlaA与多个蛋白存在不同形式的相互作用。互作蛋白主要为参与鞭毛组分的蛋白FliS、FlgE2、FliD、FlgE、FlgK、FlhA、FlaG等，这与FlaA及其他鞭毛蛋白在鞭毛组装及功能发挥中的作用相一致;与运动辅助因子Cj1340c存在相互作用[8]，说明FlaA参与鞭毛运动过程;FliA是作用于鞭毛操纵子的RNA聚合酶σ因子，分析表明FlaA表达受FliA调控;研究认为PseE 可能参与了鞭毛蛋白的糖基化修饰[9]，这与FlaA糖基化修饰位点的预测结果相呼应，提示对相应位点深入研究的必要性和方向性。

对细菌致病基因遗传信息和蛋白功能的预测分析是研究病原菌致病机制的必要基础，该研究基于空肠弯曲菌flaA基因序列信息，利用多种预测软件和分析方法，系统分析了flaA基因序列和功能特点，可为其基因功能和致病性研究以及相关功能基因分析提供基礎依据。

参考文献

[1]

BLACK R E，LEVINE M M，CLEMENTS M L，et al.Experimental Campylobacter jejuni infection in humans[J].J Infect Dis，1988，157（3）：472-479.

[2] AGUEROROSENFELD M E，YANG X H，NACHAMKIN I.Infection of adult syrian hamsters with flagellar variants of Campylobacter jejuni[J].Infect Immun，1990，58：2214-2219.

[3] WASSENAAR T M，BLEUMINKPLUYM NM，VAN DER ZEIJST B A.Inactivation of Campylobacter jejuni flagellin genes by homologous recombination demonstrates that flaA but not flaB is required for invasion[J].EMBO J，1991，10（8）：2055-2061.

[4] PEDEN J F.Analysis of codon usage[D].Nottingham：University of Nottingham，1999.

[5]

YU C S，LIN C J，HWANG J K.Predicting subcellular localization of proteins for Gramnegative bacteria by support vector machines based on n-peptide compositions[J].Protein Sci，2004，13（5）：1402-1406.

[6] KONKEL M E，KLENA J D，RIVERAAMILL V，et al.Secretion of virulence proteins from Campylobacter jejuni is dependent on a functionlal flagellar export apparatus[J].J Bacteriol，2004，186（11）：3296-3303.

[7] 吴宪明，吴松锋，任大明，等.密码子偏性的分析方法及相关研究进展[J].遗传，2007，29（4）：420-426.

[8] GOLDEN N J，ACHESON D W.Identification of motility and autoagglutination Campylobacter jejuni mutants by random transposon mutagenesis[J].Infect Immun，2002，70（4）：1761-1771.

[9] MCNALLY D J，HUI J P，AUBRY A J，et al.Functional characterization of the flagellar glycosylation locus in Campylobacter jejuni 81-176 using a focused metabolomics approach[J].J Biol Chem，2006，281（27）：18489-18498.

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