材料，利用CodonW和SPSS软件进行多元统计分析和对应性分析。结果：刺五加叶绿体基因组密码子3个位置GC的量依次为46.46%，38.26%，29.88%，其中GC1与GC2呈极显著相关关系（P<0.01），GC12与GC3的相关系数为0.205，未达到显著水平。同义密码子的相对使用频率（relative synonymous codon usage，RSCU）>1的密码子共30个，其中29个以A或T碱基结尾。对应性分析的结果表明：第1轴显示了10.35%的差异，与有效密码子数（effective number of codons，ENC）和GC3显著相关，相关系数分别为-0.288，0.353；确定了刺五加叶绿体基因组的16个最优密码子。结论：刺五加叶绿体密码子第3位偏好以A或T碱基结尾，密码子使用模式受选择和突变及其他因素共同影响，其中选择的作用略大。
[关键词]刺五加；密码子用法；密码子偏好性；GC量
刺五加Eleutherococcus senticosus是我国医药珍品，需求量较大，萜类化合物是其主要药效成分之一[1]。近年来，随着分子生物学研究的不断深入，已先后克隆出其参与药用成分生物合成的多条相关功能基因[2-3]。但在植物细胞中除核基因组外尚存在相对独立的另外2个基因组，即线粒体和叶绿体基因组[4]。叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，光合作用的全部过程都发生在叶绿体内。此外，包含萜类、酚类等在内的多种物质的代谢过程也需在叶绿体的参与下才能顺利完成，因此叶绿体在植物的能量代谢和物质代谢中都起着非常重要的作用[5]。生物体中，构成基因组的4种核苷酸形成的三联体共包含64种遗传密码，分别代表20种不同的氨基酸和翻译终止信号。一般将那些编码同一种氨基酸的密码子互称为同义密码子。不同的物种对特定的同义密码子有不同的使用偏好，且同义密码子的使用并不是随机的，而是自然选择的结果[6]。而密码子的选择性使用通过对基因翻译的准确性和效率的调节，可影响基因的表达。因此，研究叶绿体基因组密码子的使用对揭示药用植物的物质代谢具有重要的意义。
目前，刺五加叶绿体基因组的测序工作已经完成[7]，为深入研究其密码子的使用提供了丰富的数据。本文统计分析了刺五加叶绿体基因组密码子的使用方式和基因编码区的碱基组成，并对影响刺五加叶绿体密码子使用模式的主要因素进行了系统分析，确定了刺五加叶绿体基因组的最优密码子。这为研究刺五加叶绿体基因组相关特性的遗传变异，及其对刺五加物质代谢的影响奠定了基础。
1材料
从GenBank数据库中下载刺五加叶绿体基因组序列（GenBank登录号JN637765），序列全长为156 768 bp，根据其注释信息可知刺五加叶绿体基因组共包含88条基因。为减少样本误差，按惯例从基因组中挑选出以ATG为起始密码子，以TAA，TAG，TGA为终止密码子、且编码区序列长度大于300 bp（100个氨基酸）的蛋白质编码基因作为序列分析样本[8]。剔除5条重复基因序列后，最终获得52条符合条件的全长蛋白编码区序列，作为本研究的序列样本。
2方法
2.1同义密码子使用偏好性分析利用CodonW 1.4.4程序计算样本的总体GC量以及密码子第1，2，3位核苷酸上的GC量，分别记为GC，GC1，GC2，GC3。同时利用该软件计算同义密码子的相对使用频率（relative synonymous codon usage，RSCU）、有效密码子数（effective number of codons，ENC）、密码子偏好指数（codon bias index，CBI）和密码子适应指数（codon adaptation，CAI），并进行对应性分析。通过SPSS 17.0软件进行相关性检验。
2.2中性绘图分析将各基因的GC1和GC2的平均值记为GC12，以GC3为横坐标，GC12为纵坐标，分析密码子3个位点的碱基组成之间的相关性，确定影响密码子偏性的因素。若GC3与GC12显著相关，则说明密码子3个位点上的碱基组成无差异，密码子的偏好受突变的影响；若两者的相关性不显著，说明密码子不同位点的碱基组成不同，基因组GC含量高度保守，密码子的偏好特点受选择的影响比重较大。
2.3ENC绘图分析以GC3为横坐标，ENC为纵坐标，构建二维散点图。并以密码子偏性仅由碱基组成决定时的基因预期值{计算公式为 ENC=2+GC3+29/[GC32+（1-GC3）2]}构建标准曲线。当某基因的密码子偏性仅受突变影响时则分布于曲线附近，若其受选择影响较大则分布于曲线下方较远的位置[9]。
2.4对应性分析基于各基因的RSCU，利用CodonW程序进行对应性分析。
2.5最优密码子分析以ENC为标准，将满足统计标准的52条基因中ENC值居于最高和最低的10%样本分别作为高、低表达组。分别计算其对应的各密码子的RSCU，若两者间的RSCU差值（ΔRSCU）>0.08，则确定其为高表达最优密码子[9]。
3结果与分析
3.1密码子偏性分析利用在线工具CUSP分析叶绿体基因组编码区的结果见表1。叶绿体编码区的GC量为38.20%，与整个叶绿体基因组的GC量37.95%基本一致[7]。但密码子3个位置的碱基组成间存在显著差异，表现为GC1（46.46%）>GC2（38.26%）>GC3（29.88%），其中GC1，GC3的GC量与编码区和整个基因组的GC量差别较大，GC2与其基本相当。即在刺五加叶绿体的基因组中，以A或T碱基结尾的密码子使用频率高于G或C碱基结尾的密码子。ENC的取值20～61，ENC越靠近20时表示同义密码子偏性越大，越靠近61时表示同义密码子偏性越小。刺五加叶绿体基因组编码区的ENC取值在34.95～54.38，其中71.15%基因的ENC大于45，说明刺五加叶绿体基因组编码区的偏性较弱。
刺五加叶绿体基因组编码区密码子各位置的GC含量、ENC和密码子数目的相关关系见表2。整个编码区的GC含量与GC1，GC2之间的相关性均达到了极显著水平（P<0.01），与GC3之间也达到了显著水平（P<0.05）。GC1与GC2之间相关性达到极显著水平（P<0.01），但GC1，GC2，GC3均未达到显著水平，说明刺五加叶绿体基因组密码子的第1位与第2位碱基的组成较相似，但与第3位碱基组成间存在显著差别。ENC与密码子第1位和第2位GC含量的相关性未达显著水平，但与第3位的GC含量间的相关性达到了极显著水平（P<0.01），说明第1和第2位的碱基组成对密码子偏性影响较小，而密码子第3位的碱基组成对密码子偏性作用较强。ENC和密码子数的相关系数为0.253，未达到显著水平，表明密码子数目对ENC的影响很弱。因此，可以排除因基因自身序列过短而可能对密码子偏性分析造成的干扰。
RSCU是某个特定密码子的实际观察值与理论观察值之间的比值。若RSCU>1，则密码子出现的频率比其他同义密码子高，反之，出现则低；若RSCU=1，则密码子使用无偏性。刺五加叶绿体基因组编码区的RSCU见表3。起始密码子ATG和色氨酸的密码子TGG的RSCU为1。RSCU>1的密码子共30个，其中29个以A或T碱基结尾，这些是刺五加叶绿体基因组的偏好密码子。RSCU<1的密码子共32个，其中29个为G或C碱基结尾，这些是刺五加叶绿体基因组的非偏好密码子见表3。
3.2中性绘图分析刺五加叶绿体基因组各基因的中性绘图分析结果表明，各基因均分布于对角线上方。GC3的分布在0.205 9～0.376 2，GC12的分布在0.332 1～0.564 8，两者分布范围均较小。GC12与GC3的相关系数为0.205，双尾检验未达到显著水平，回归曲线斜率为0.264 1，说明GC12与GC3的相关性很弱，密码子3个位置的碱基构成不同，各位置的GC含量高度保守，突变在密码子偏性形成过程中作用较弱，选择在此过程中的作用较强。
3.3ENC和GC3的相关性分析以刺五加叶绿体基因组各基因的GC3量为横坐标，ENC为纵坐标将各基因分布于平面图中见图1。刺五加叶绿体的各基因中仅少量基因沿期望值曲线分布或落在期望值曲线附近，偏性较弱，而多数基因则分布于期望值曲线的下方，偏性较强。说明刺五加叶绿体基因组的密码子偏性除了由碱基突变引起的差异外，更多地受到选择效应的影响。
3.4对应性分析基于RSCU的对应性分析结果显示，第1轴显示了10.35%的差异，另外3个量轴依次分别显示了8.87%，7.86%，7.38%的差异。前4轴差异合计34.36%，以第1轴为主，其余各轴差异不明显。第1轴与ENC和GC3呈显著负相关关系，相关系数分别为-0.288，0.353；与CAI和CBI的相关系数分别为0.147，0.088，但均未达显著水平。说明GC3对刺五加叶绿体密码子的偏性有较大的影响，同时其他因素对刺五加叶绿体密码子的偏性也有一定影响，其使用模式形成过程较为复杂。
将刺五加叶绿体各基因根据功能分为5类，分别为光合系统基因（包括psa，psb，pet，atp，ndh，rbcL，共25条）、核糖体蛋白基因（包括rpl和rps，共14条）、遗传系统基因（4条rpo）、ycf基因家族（4条）和其他基因（5条）。以第1轴为纵坐标，第2轴为横坐标将刺五加叶绿体各基因分布于平面中。其中遗传系统基因集中分布，而其他基因则因功能不同而分散度较大见图2。
3.5最优密码子分析根据各基因ENC的大小，选择高、低表达基因进行建库，分别计算高、低表达基因库各密码子的RSCU见表3。根据两库密码子的RSCU值，最终确定TTT，GTT，ATT等16个密码子为最优密码子。
4讨论
密码子第3位发生的突变多为同义突变，而在第1，2位上发生的碱基改变则会造成氨基酸的改变。因此，生物体在生存压力的作用下，形成密码子3个位点上保留突变的概率不同的现象[9]。对刺五加叶绿体基因组的分析结果表明，其密码子第3位与前2位的碱基组成不同，第3位的碱基的使用受突变的影响较小，而受选择的作用较大。同时ENC和GC3相关性分析的结果显示，除部分基因存在于标准曲线附近外，多数位于标准曲线下方，即这些基因相对于突变而言，受选择的作用较强。
本研究中，刺五加叶绿体基因组偏向使用第3位为A或T的密码子，其与碱基类型相关的GC3，GC指标均与第1轴显著相关，说明碱基差异对刺五加叶绿体基因组密码子的偏好性存在较大影响（r=0.353），同时反应选择作用强度的指标ENC也与第1轴显著相关（r=-0.288），且CAI和CBI虽未与第1轴达到显著相关水平，但其相关系数确也分别达0.147，0.088。这说明，刺五加叶绿体基因组的密码子用法受碱基组成（突变）和选择等多种因素影响，其中，选择的作用略大于突变的作用。这与银白杨[10]和陆地棉[9]叶绿体基因组密码子的用法较为相似。
关于最优密码子的确定方法，不同的报道不太一样。选择了陆地棉[9]中使用的最优密码子筛选方法，确定了16个最优密码子。这对通过基因工程对其进行改造和未知基因的分析具有重要的意义。
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（College of Life Science， Hebei United University， Tangshan 063000， China）[Abstract]Objective： To analyze the codon usage of chloroplast genome and the influencing factor in Eleutherococcus senticosus. Method： Codon of 52 genes， which were selected from the chloroplast genome sequence of E. senticosus， was multivariate statistical and correspondence analyzed using CodonW and SPSS software. Result： GC content at the three position of codons by turns was 46.46%，38.26%，29.88%， whereas GC1 and GC2 had a significant correlation coefficient （P<0.01）. The correlation coefficient with GC12and GC3 was 0.205 and was not significant coorelated. There were 30 codons which relative synonymous codon usage was greater than 1 and 29 codons end with A and T. In the corresponding analysis， the first axis shows 10.35% variation. And there was significant correlation coefficient between ENC and GC3. The correlation coefficients with GC3 and ENC were -0.288 and 0.353， respectively. We defined 16 codons from 16 amino acids as the major preference codons in chloroplast genome of E. senticosus. Conclusion： The third positions for all codon are preferred to ending with A and T. The codon usage bias is formed under effect of mutation and selection， as well as other factors. But the selection will have a far greater impact than others.
[Key words]Eleutherococcus senticosus； codon usage； codon bias； GC contents
doi：10.4268/cjcmm20130508[责任编辑吕冬梅]
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