油茶优良无性系‘闽43’和‘闽60’果实发育过程中油脂积累规律研究

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摘 要 以油茶优良无性系‘闽43’和‘闽60’所产果实为试材，研究油茶果实生长发育过程中油脂积累规律。结果表明，‘闽43’和‘闽60’种子中乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）和磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性均在9月至果实成熟期间快速上升，基本上与种子内油脂合成的高峰期相吻合，ACCase和PPase活性与种子中粗脂肪含量均呈显著正相关，表明油茶种子内ACCase和PPase活性促进了油脂合成。两无性系种子的粗脂肪含量与可溶性蛋白含量呈显著正相关，与还原糖含量呈极显著负相关，与可溶性淀粉含量呈极显著正相关。可见油脂的积累伴随着蛋白质与糖类的代谢、分解与转化，推测一部分的蛋白质和糖类可被代谢转化形成油脂。

关键词 油茶；果实生长发育；油脂积累；油脂合成相关酶

中图分类号 S606.2 文献标识码 A

油茶（Camellia oleifera Abel.）属山茶科山茶属常绿小乔木或灌木，广义上油茶泛指山茶属中油脂含量较高并具有一定栽培面积的物种，与油棕、油橄榄、椰子并称为“世界四大木本食用油料植物”[1-2]。油茶极具利用价值，其果实中的茶籽榨取的茶油色清而味香。茶油中亚油酸和亚麻酸的含量比例为4 ∶ 1，是营养学界里最佳配比的“脑黄金”。茶油的脂肪酸结构和比例与橄榄油极其相似，有“东方橄榄油”的美称[3]。

油脂是木本食用油料植物果实的主要成分，因此含油量成为评价油料植物果实品质的重要指标。Mahmood等对112个芥菜型油菜DH系进行研究，发现油脂含量与蛋白质含量呈显著负相关[4]。目前，对于油茶果实的研究大多集中在与果实含油量相关的影响因子[5-6]、成熟果实脂肪酸组成分析[7-9]、果实病虫害防治[10-12]、油茶果实表型性状的变异[13-16]以及采后生理[17-19]等几个方面，对油茶果实采前生理即生长发育过程的系统研究较少。本文以福建省油茶主栽无性系‘闽43’和‘闽60’为材料，研究油茶果实生长过程中油脂积累的变化规律，旨在揭示油茶果实生长发育及油脂转化的特点，为栽培实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为福建省2个普通油茶优良无性系‘闽43’和‘闽60’所产的果实，这2个无性系种植于福建省闽侯县桐口国有林场油茶种质资源圃，和其它无性系一起采用完全随机区组试验，每个无性系10株为一小区，共3个区组。该林场地处E 119°17"、N 26°05"，气候温和，雨量充沛，海拔高度约为100 m，适宜油茶生长。课题组前期已对这两个无性系的果实形态性状进行了测定[20]。

1.2 方法

1.2.1 样品采集方法 2014年4月1日至11月9日，对各无性系果实进行观察和取样测定。选取树体特征与生长条件基本一致的无病虫害植株，在晴朗或阴天的上午10 ： 00左右定期连续采样，共采样12次。7月10日之前每隔30 d采1次，7月10日之后油脂合成逐渐增多，适当缩短取样时间，每隔15 d采集1次，直至果实完全成熟。在油茶种质资源圃中每个区组随机采集3个植株的果实，每个植株从东南西北4个方向采收生长发育期接近、无病虫害的果实各10个。采摘的油茶果实用干冰带回实验室，立即敲碎分离果皮和种子，待种皮硬化后剥离，将种子用液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.2 粗脂肪及果实营养成分的测定 粗脂肪的测定采用索氏抽提法，参照陈永忠等[21]的方法。可溶性糖、蔗糖的测定参考张志良等[22]的方法。可溶性蛋白、还原糖的测定参照王学奎[23]的《植物生理生化实验原理和技术》，其中可溶性蛋白采用考马斯亮蓝G-250染色法；可溶性淀粉的测定参照宗学凤等[24]的蒽酮比色法。

1.2.3 乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）活性的测定

参照杨若琳等[25]的方法稍作改进。称3 g鲜样，切碎于研钵中，加入少量石英砂后再加入5 mL预冷的提取Buffer快速研磨，转入50 mL离心管，于研钵中再加入5 mL预冷的提取Buffer将残余的样品全部转移至离心管内，4 ℃条件下静置2 h。将静置后的匀浆液离心30 min（4 000 r/min，4 ℃），留清液弃沉淀。将上清液继续离心30 min（10 000 r/min，4 ℃），棄去沉淀，保留上清液，即为待测液，转入1.5 mL的离心管内备用。应用植物乙酰辅酶A羧化酶（ACC）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒的说明方法对ACCase的活性进行测定。

1.2.4 磷脂酸磷酸酯酶（PPase）活性的测定

参照西北农业大学的实验指导测定[26]，酶活性以每小时每毫克蛋白质产生的P的毫克数，单位为mg/（g·h）。

1.3 数据处理

利用Excel 2003软件对数据进行处理绘图。用SPSS 20.0软件进行方差分析、多重比较和相关分析。

2 结果与分析

2.1 粗脂肪含量变化

油茶‘闽43’与‘闽60’果实粗脂肪含量的动态变化如图1所示，果皮和种子中粗脂肪含量变化差异大，果皮中粗脂肪含量整体水平较低。‘闽43’果皮中粗脂肪含量在8月9日前甚微，8月9日后缓慢增多，9月10日达到最大值2.94%，此后逐渐下降；种子中粗脂肪含量在6月10前含量同样甚微，几乎无测出，7月10日后开始缓慢增加，9月26日后粗脂肪含量开始急剧上升，在果实成熟时达到最大值45.05%。‘闽60’果皮中粗脂肪含量在7月26日前几乎无测出，在8月9日达到最大值1.90%，此后逐渐下降；种子中粗脂肪含量在9月10日前均处于较低水平，9月10日后几乎呈线性上升直至果实成熟，成熟时果实粗脂肪含量为43.48%。总体上，可以看出油茶果实中脂肪的积累主要在种子中，且油茶种子中粗脂肪的积累主要在生长的中后期，这与大多数的油料植物种子中脂肪的积累规律相近。

2.2 乙酰辅酶A羧化酶活性变化

油茶‘闽43’与‘闽60’果实内ACCase活性的动态变化如图2所示，两无性系果皮中ACCase活性变化幅度较小，维持在较低水平波动。‘闽43’种子中ACCase活性在7月26日前与果皮基本一致，处在较低水平，7月26日之后酶活性开始缓慢上升，9月26日后开始急剧上升，果实成熟时达到最大值2 929.19 U/L。而‘闽60’种子中ACCase活性在9月10日前与果皮基本一致，处于较低水平波动变化，9月10日之后酶活性开始呈近似线性快速上升，直至果实成熟时达到最大值2 157.68 U/L。

2.3 磷脂酸磷酸酯酶活性变化

油茶‘闽43’与‘闽60’果实内PPase活性的动态变化如图3所示，两无性系果皮中PPase活性变化幅度较小，维持在较低水平，总体上呈下降趋势。‘闽43’种子中PPase活性在7月26日前处在较低水平，且呈缓慢下降趋势，7月26日之后酶活性开始急剧上升，果实成熟时达到最大值60.30 mg/（g·h）。而‘闽60’种子中PPase活性在8月9日前与果皮基本一致，稳定在较低水平，8月9日之后酶活性开始呈近似线性快速上升，直至果实成熟时达到最大值83.96 mg/（g·h）。

2.4 油茶果实生长发育期间脂类合成酶与粗脂肪的相关性分析

‘闽43’和‘闽60’果皮和种子中ACCase活性和PPase活性与粗脂肪的相关性分析如表1所示。由表1可见，两无性系果皮中ACCase活性均与粗脂肪含量呈正相关，但相关系数不大；而两无性系果皮中PPase活性均与粗脂肪含量呈负相关，其中‘闽43’果皮中PPase活性与粗脂肪含量呈显著负相关（p<0.05）。两无性系种子中ACCase活性均与粗脂肪含量呈极显著正相关（p<0.01）；PPase活性也均与粗脂肪含量达到极显著正相关（p<0.01）。表明油茶种子中高活性的ACCase和PPase极大促进粗脂肪的合成。

2.5 油茶果实生长发育期间粗脂肪与其它果实性状的相关性分析

为了探讨油茶果实中油脂积累与其它果实性状的相关关系，在‘闽43’和‘闽60’果实粗脂肪含量迅速增加到峰值期间，对果形、可溶性糖、蔗糖、还原糖、可溶性淀粉、可溶性蛋白含量的动态变化与种子中粗脂肪含量进行了相关分析。由表2可以看出，两无性系种子的粗脂肪含量均与可溶性蛋白含量呈显著正相关（p<0.05），与还原糖含量呈极显著负相关（p<0.01），与可溶性淀粉含量呈极显著正相关（p<0.01）。其中，‘闽60’种子中粗脂肪含量与果形指数呈显著负相关（p<0.01）。

3 讨论与结论

本试验结果表明，两无性系均表现为果皮粗脂肪含量远低于种子中粗脂肪含量，表明油茶果实中种子含油量占极大份额。‘闽43’果实比‘闽60’更早开始油脂的合成，但两无性系油脂合成的高峰期均主要集中在9月10日至果实成熟期间。

油脂的合成起始于ACCase催化乙酰-CoA生成丙二酰-CoA，ACCase是催化脂肪合成的限速酶。三酰甘油是通过二酰甘油转化生成的，而二酰甘油的形成得益于PPase的催化作用[27]。本试验发现，‘闽43’和‘闽60’果皮中ACCase和PPase活性均稳定于低水平范围，而种子中ACCase和PPase活性均在9月至果实成熟期间快速上升，基本上与种子内油脂合成的高峰期相吻合，此期间ACCase和PPase活性与种子中粗脂肪含量的正相关都达到极显著水平，表明油茶种子内ACCase和PPase是参与油脂合成代谢的调节酶，在果实生长发育过程中，其活性的大小可以促使粗脂肪含量发生变化。同时，在此期间两无性系种子的粗脂肪含量与可溶性蛋白含量呈显著正相关（p<0.05），与还原糖含量呈极显著负相关（p<0.01），与可溶性淀粉含量呈极显著正相关（p<0.01）。油脂的积累伴随着蛋白质与糖类的代谢、分解与转化，推测一部分的蛋白质和糖类在油脂转化过程中形成油脂，这与张凌云等[28]的研究结果相吻合。而‘闽60’种子中粗脂肪含量与果形指数呈显著负相关（p<0.01），表明果形指数可作为此品种果实采集的一个标准。

通过比较可以发现，在油脂合成高峰期，‘闽43’种子内ACCase活性水平（1 339.19 ～2 929.19 U/L）顯著大于‘闽60’（1 161.66～2 157.68 U/L），这大概也是引起两油茶无性系种子粗脂肪含量差异的主要原因之一。油脂的生物合成是由数十种酶共同参与，除了ACCase和PPase外，还有许多其他酶对油脂的合成过程具有调节作用，如植物脂肪酸合酶系统（FAS）和植物脂酞ACP脱饱和酶等，本文仅初步探索了油茶果实中ACCase和PPase活性的变化，而油脂转化和积累过程中相关的其他酶及其作用还需进一步深入研究。

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