Survivin靶向治疗研究进展

[中图分类号]R730.5　[文献标识码]A　[文章编号]1672-4208(2009)23-0030-03

Survivin是一种在肿瘤细胞中高表达的抗凋亡蛋白，对肿瘤细胞的增殖、侵袭和复发起到非常重要的作用。因此，利用抗Survivin的靶向治疗在肿瘤的治疗策略方面越来越受到关注。

1　Survivin基因结构

Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosisfamily of protein，IAPs)中结构独特最小的1个新成员。人Survivin基因定位在染色体17q25端粒部位，基因总长度约14.7 kh，由4个外显子和3个内含子组成。作为凋亡抑制蛋白家族成员之一其结构与同族的其它成员不同。Sur-vivin的结构比较独特，只包含一个BIR结构域并不包含环指结构。Survivin基因经过转录可被选剪接成4种Sur-vivin的mRNA剪接体，进而翻译成不同蛋白质。其中Sur-vivin蛋白的胞浆表达与发挥肿瘤的抗凋亡特性相符，作用的关键部位是Survivin蛋白N端的BIR结构域。

2　Survivin蛋白表达分布与功能

2.1　Survivin蛋白表达分布Survivin蛋白几乎在所有恶性肿瘤细胞中异常高表达，在恶性肿瘤细胞中都能检测到Survivin的mRNA和蛋白。近年研究发现Survivin除表达于肿瘤组织细胞和胚胎组织外，也表达于人体分化成熟的组织细胞。只是Survivin在正常组织细胞如肝星状细胞、原始造血细胞、T淋巴细胞、血管内皮细胞、胸腺等表达量较少。目前已发现4种Survivin的mRNA剪接体，共产生5种蛋白亚型包括Survivin、Survivin－2a、Survivin－3B、Sur-vivin－DEx－3和Survivin-2B。前4种蛋白亚型都有较强的抗凋亡作用，但Survivin－2B蛋白缺乏BIR结构因而抗凋亡作用明显减弱。研究发现5种蛋白亚型具有不同的亚细胞定位。蛋白的亚细胞定位与核质转运密切相关，其中核输出信号(Nuclear export signals，NES)与核输出受体Crml结合至关重要。Survivin的BIR区与COOH末端之间a螺旋结构就是NES，因此Survivin/Crml相互作用使Survivin主要定位于细胞质，而Survivin－△EX3缺乏NES主要定位于胞核。由于几种蛋白的亚细胞定位不同，因而在肿瘤细胞的凋亡与抗凋亡平衡机制中各自具有不同的生物学功能。最近研究表明Survivin及其剪切体亚细胞定位还与肿瘤预后有相关性。

2.2　Survivin蛋白功能Survivin是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，其抗凋亡的机制主要是通过直接或间接抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用。Survivin可与辅助性线粒体源性easpase激活因子(sMAC)结合，SMAC是一种通过结合lAP而保护caspase活性的蛋白，Survivin结合SMAC就可以对抗IAP的保护作用间接抑制caspase活性；Survivin也可直接结合caspase－9发挥抗凋亡作用。另外Survivin。n以二聚体形式存在，其表达具有周期性，主要在细胞有丝分裂G2/M期表达。在有丝分裂G2/M期，Survivin可与有丝分裂纺锤体的微管特异性结合，调节细胞有丝分裂，具体机制尚不明确。有研究表明Survivin与极光激酶B(aurora B)、内着丝粒蛋白(INCENP)构成的染色体过客蛋白复合体(chromosomal passenger complex，CPC)能在染色体和纺锤体间移动，与中心纺锤体中央区中期染色体的着丝粒结合，参与染色体分离和胞质分裂。同时，Survivin在癌细胞中的过度表达可能促进其跳过细胞周期检查点通过有丝分裂而促进癌细胞增殖。Survivin与血管形成有密切关系。血管形成过程的核心是血管内皮细胞的分裂增殖，主要取决于血管内皮细胞的增殖和凋亡平衡的结果。研究发现在正常血管内皮细胞中Survivin表达量少，而在新生肉芽组织中的内皮细胞表达量增高。血管生成过程中，一些促血管生成因子如血管内皮生长因子可通过上调Survivin表达，抑制细胞凋亡从而促进血管内皮细胞增殖。

3　Survivin靶向治疗

近年在肿瘤的治疗方面呈现出越来越多的方法，临床上以肿瘤的化疗和放疗多见，但不良反应异常大。目前大多数研究都集中在肿瘤基因水平的干预，通过对肿瘤基因的干扰而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和复发，从而达到治疗肿瘤的目的。Survivin选择性地高表达于人类肿瘤组织，在正常组织中表达量很少。因此Survivin与肿瘤的发生、发展密切相关，其抗凋亡作用、促血管生成及参与细胞周期调节等作用引起人们的研究兴趣，Survivin已成为一个有潜力的肿瘤靶向治疗靶点。

3.1　基因治疗

Li等是较早应用Survivin反义cDNA抑制Survivin表达使Survivin的表达下调或使其表达的Survivin无功能。其机制是在肿瘤细胞有丝分裂时，Survivin的表达下调使Survivin、Caspase-3和P21复合体超分子组装分裂，导致P21裂解形成多极纺锤体，最终不能完成整个细胞一分为二，从而抑制细胞分裂增殖。Olie等针对SurvivinmRNA设计出6条反义寡核苷酸(antisense oligonueleotide，ASODN)，以下调mRNA作用最强的ASODN4003转染肺癌细胞株A549。结果发现肺癌细胞的细胞核浓缩和核破碎，细胞凋亡增加而增殖受到抑制。最近Norihiro Hayashi等人利用腺病毒(具有表达靶向Survivin的反义核苷酸)感染人前列腺癌细胞DUl54后48 h，发现Survivin表达明显下降，癌细胞生长减慢、凋亡增加。

一些研究发现利用突变腺病毒介导的Survivin基因突变体pAd-T34A感染乳腺癌、结肠癌、肺癌等肿瘤细胞，产生显性负性作用，导致这些肿瘤细胞凋亡增加，而并不影响纤维母细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等正常细胞的增殖。将pAd-T34A与化疗药物紫杉醇组装后，作用于肿瘤细胞导致其生长抑制甚至死亡。另一些研究证实，Survlvin发挥抗凋亡的功能需要P34cdc2介导Survivin+34Thr的磷酸化，转染了T34A的肿瘤细胞干扰了内源性Surviviu+34Thr的磷酸化，使Survivin通路调节紊乱也导致肿瘤细胞发生凋亡。进一步研究将反义寡核苷酸与化疗药物同时作用于肿瘤细胞发现二者具有协同促凋亡作用，其主要途径是同时下调Survivin表达，加速肿瘤细胞凋亡的进程。

Survivin基因启动子的使用也是一种基因治疗方法。

研究证实：利用Survivin基因启动子可以启动肿瘤细胞的细胞毒性基因表达，当Survivin基因启动子与前凋亡蛋白Bik偶联形成一种自杀性构建体，就可以抑制肺癌细胞的增殖。最近研究表明，Survivin启动子基立于有条件的复制性腺病毒(CRAds)，就能迅速自我复制并可杀灭各种神经胶质瘤细胞，同时也能在体内明显抑制神经胶质瘤移植物的生长。

3.2　核酶技术核酶是一种具有特异性内切核酸酶活性的小分子RNA。其功能是对靶向RNA特定部位酶切磷酸二脂键导致RNA分子断裂，使RNA不能发挥生物学活性。近年来研究出一种具有携带外源效应分子的RNA载体分子pRNA，将pRNA与靶向Survivin核酶组装形成pRNA/Survivin核酶嵌合体。由于这种核酶嵌合体具有容易进入细胞且不易降解等优点，将其转染人肿瘤细胞后就可在特定位置更好地发挥内切核酸酶活性，靶向治疗的特异性更高，肿瘤细胞死亡率明显增加。

3.3　免疫治疗由于Survivin具有肿瘤的普偏抗原性，因此Survivin蛋白被作为一种新型的免疫治疗靶点。近年研究发现在肿瘤患者血液中检测到抗Survivin自身抗体，一些患者在肿瘤疾病诊断之前血液中就可检测到抗Survivin自身抗体。Smith等在膀胱癌患者的尿液中亦检测到SurVIVIn，这些高敏感高特异的检测为肿瘤的早期诊断提供了新途径。因此推测抗Survivin抗体和Survivin可能是早期预测的肿瘤标志物。目前免疫治疗已进入了一期临床试验，如在慢性淋巴细胞白血病、乳腺癌、黑色素瘤等病人中证实Survivin由细胞毒性T淋巴细胞介导免疫。进一步研究发现利用体外细胞溶解的T淋巴细胞方法诱导出针对Survivin抗原表位的T细胞，这种T细胞可对多种人类肿瘤细胞产生溶细胞活性，而对正常组织细胞无明显毒副作用。因而证实免疫治疗具有一定安全性，且无明显不良反应。免疫疗法在肿瘤的治疗方面具有合理性和可行性，是一种新型的可行方法。

3.4　RNA干扰技术

RNA干扰(RNAi)技术是一种新的基因沉默方法，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double－strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。其分子机制是干扰RNA转入细胞后被分解成有意义链和反义链。其中有意义链被降解，反义链与细胞内一些蛋白组装成RNA诱导的沉默复合体。沉默复合体中的RNA分子与mRNA互补结合，将mRNA降解从而抑制靶基因表达。由于Survivin在肿瘤细胞中普遍高特异性表达，并与肿瘤的增殖、凋亡密切相关，因而利用干扰RNA技术抑制Survivin基因表达倍受关注。

研究发现人工合成21至23个核苷酸的RNA片段可以诱导哺乳动物细胞RNAi的应答，并且能明显抑制靶基因的表达，因而为利用小干扰RNAs(siRNA)治疗肿瘤的研究提供了新思路。Carvalho等首次利用RNAi抑制子宫颈癌细胞Survivin表达。Coma等将Survivin的siRNA转染人内皮细胞导致凋亡率明显增加。一些研究者还发现在转染siRNAs的癌细胞60小时后，就不能检测到Survivin表达，并且癌细胞的有丝分裂被延迟。人类肿瘤细胞模型中，以脂质体或者病毒为载体将RNAi转染人肿瘤细胞，发现RNAi介导Survivin下调并导致肿瘤细胞增殖受阻、凋亡增加。Survivin下调同样可增强肉瘤细胞化疗敏感性及野生型P53的线性表达。

3.5　小分子拮抗

3.5.1　热休克蛋白90抑制剂

最近研究发现，肿瘤细胞Survivin的高表达与细胞内热休克蛋白90(Hsp90)高表达密切相关。Survivin与Hsp90相结合形成复合体，从而可以保护Survivin不被泛素2蛋白酶体降解，增加Survivin稳定性。由于Survivin与Hsp90结合区位于其Lys79至Leu87区域，因而有研究者设计与其相同序列的肽类，命名为Shepherdin，是一种热休克蛋白90抑制剂。Shepherdin可以抑制Survivin－Hsp90复合体的形成，使Survivin稳定性下降导致其大量降解。其分子机制是Shepherdin竞争性结合ATP抑制了Hsp90分子伴侣的功能；另外Shepherdin可使一些Hsp90客户蛋白稳定性降低，并诱导肿瘤细胞经过凋亡与非凋亡途径发生死亡。Shepherdin这种对肿瘤细胞毒性作用并不依赖于细胞的增殖活性，而是伴随着一些细胞保护性因子如Bcl-2和P53的高表达。更有意义的是，Shepherdin可以选择性发挥抗凋亡作用，而对正常细胞的活性并没有影响。免疫组织化学方法证实，用Shepherdin处理肿瘤细胞之后，Hsp90客户蛋白AKT表达水平几乎完全消失，同时Survivin的表达也明显减弱。

目前利用计算机重组构建方法，设计出一种与Shepherdin的分子构象和化学活性相似的非肽类小分子物质，命名为5－氨基咪唑－4－甲酰胺－I－B－D－呋喃核糖苷(AICAR)。当AICAR选择性结合Hsp90的N末端结构域之后，使一些Hsp90客户蛋白和Survivin稳定性下降，从而对肿瘤细胞发挥促凋亡、抗增殖作用，并不影响人成纤维母细胞的增殖。

3.5.2　细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin－dependent kinase，CDK)抑制剂最近研究发现，用紫杉醇处理的肿瘤细胞在有丝分裂期可检测到细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin－dependent kinase，CDK)抑制剂。CDK抑制剂可以使肿瘤细胞逃逸紫杉醇阻止细胞的有丝分裂，而进一步激活了线粒体依赖性的凋亡途径和抗癌活性，导致肿瘤细胞发生凋亡。其他一些小分子拈抗物也在研究中，它们分别通过直接或者间接途径影响肿瘤细胞Survivin的表达，发挥抗肿瘤的作用。如：抑制肿瘤细胞Survivin基因的转录和翻译水平；调节肿Survivin蛋白信号传导通路等。但是这些分子拮抗物发挥作用的分子机制尚未完全清楚，有待进一步阐明。

4　结论与展望

Survivin是IAP家族结构独特最小的1个新成员，参与了肿瘤发生发展多个环节。Survivin具有抑制肿瘤细胞凋亡，促进增殖，促进肿瘤新生血管的生长，调节肿瘤细胞有丝分裂周期等作用。在体内和体外实验分别采用不同方法干扰肿瘤细胞Survivin的表达、抑制Survivin的功能从而诱导肿瘤细胞凋亡，达到肿瘤治疗的目的。Survivin作为肿瘤治疗最有前景的分子靶点地位也得到提高。

Survivin作为肿瘤治疗靶点取得了一些成果，但是各项研究技术尚未完全成熟，同时也存在一些负面效应。由于Survivin在正常组织细胞中也有微量表达，因此各种针对Survivin的肿瘤治疗也可能影响到正常细胞的增殖和凋亡。如何最大极限的发挥抗肿瘤细胞作用，最小限度影响正常组织细胞功能还需进一步明确survivin在肿瘤细胞与正常细胞中表达及功能的差异。另外survlvfl靶向治疗应用还存在一些局限性，主要存在的问题是Survivin基因靶点如何精确定位，而不出现非特异性的毒副作用。因此，在加强靶基因的精确定位与减少其副作用方面仍需进一步研究。

Survivin的亚细胞定位与其抗凋亡作用的发挥相关，而Survivin的核质转运需要Survivin/Crml相互作用。因此推测利用抑制剂干扰Survivin/Crml相互作用，可能抑制Survivin抗凋亡作用。目前已有研制出非特异性的核输出抑制剂，但因其对正常组织细胞也存在副作用，所以特异性蛋白核输出抑制剂还需要进一步研制。另外，核输出信号(Nuclear export signals，NES)具有一定特异性，因而特异性Survivin的NES抑制剂有一定的研究前景。

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