木瓜斑点落叶病菌生物学特性及室内药剂筛选

材料与方法

1.1 菌株来源、培养基和供试农药

木瓜斑点落叶病菌自西南林业大学校园木瓜病叶上分离得到，菌种保存于西南林业大学林学院森保教研室，菌株编号MGB1。

供试培养基[9]：①清水琼脂（Water agar，WA）：琼脂粉15 g，去离子水1 000 mL。②查氏培养基（Czapek agar，CA）：蔗糖30 g，硝酸钠3 g，氯化钾0.5 g，硫酸铁0.01 g，硫酸镁0.5 g，磷酸二氢钾1 g，琼脂15 g，去离子水1 000 mL。③玉米粉培养基（Corn meal medium，CMM）：玉米粉40 g，蔗糖10 g，琼脂15 g，去离子水1 000 mL。④马铃薯葡萄糖培养基（Potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，去离子水1 000 mL。

供试药剂为9种生产上常用农药（表1），药剂浓度依次为推荐浓度、稀释2倍浓度、稀释4倍浓度。

1.2 不同营养和环境条件对病原菌生长的影响

1.2.1 不同培养基对病原菌生长的影响 不同培养基培养5 d，用5 mm的打孔器自病菌菌落边缘打取菌饼，分别接种在上述4种不同培养基平板中央，置于28 ℃培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径并记录，每处理3个重复，试验重复3次（培养条件和重复次数下同）[10]。

1.2.2 不同碳源和氮源对病原菌生长的影响 以CA培养基为基础培养基，分别用含有相当碳元素的葡萄糖、甘露醇和可溶性淀粉取代其中的蔗糖，配制成不同含碳培养基，以不加碳元素的培养基为对照。分别用含有相当氮元素的硝酸钙、硝酸铵和尿素取代其中的硝酸钠，并以不加氮元素的培养基为对照[11]。

1.2.3 不同pH对病原菌生长的影响 用1 mol/L NaOH或HCl调节PDA培养基的pH至4、5、6、7、8、9和10共7个梯度[11]。

1.2.4 不同致死温度对病原菌生长的影响 打取3个直径为5 mm的菌饼，移至含有5 mL去离子水的试管中，分别置于40、45、50、55、60、65 ℃水浴10 min，取出后冷却至室温。将处理后的菌饼接种到PDA平板中央，置于28 ℃培养观察。

1.2.5 不同光照和通气对病原菌生长的影响 将光照培养箱分别设置3种不同光照条件（光/暗，h）：0/24、12/12和24/0[12]。通气处理采用培养皿用Parafilm封口和不封口两种处理方法[13]。

1.3 室内药剂平板筛选

采用菌丝生长法测定药剂对病菌的相对抑制效果。将供试药剂与熔化后的PDA培养基混合，制成一定浓度的含药平板，以不加药剂的PDA平板为对照。病菌活化5 d后，用打孔器打成5 mm的菌饼，接种于含药平板中。28 ℃恒温培养箱培养，5 d后测量菌落直径，计算相对抑菌率。每个浓度重复3次，试验重复3次。取浓度对数值为x，相对抑菌率值为y，求出毒力回归方程[14]，并计算供试药剂对病原菌的有效中浓度EC50以及EC70、EC90[15]。

菌落净直径=菌落直径-菌饼直径

相对抑菌率=（对照菌落净直径-处理菌落净直径）/对照菌落净直径×100%

1.4 数据分析

用Excel 2010对数据进行处理、作图和差异显著性分析（P<0.05）。所有图形和表格中的正负偏差均为标准偏差。用回归程序得到毒力回归方程、相关系数、EC50、EC70和EC90。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对病原菌生长的影响

在供试的4种培养基中，病原菌在PDA上生长速度最快，菌丝最浓密，其次是CMM培养基，而在WA琼脂培养基上菌落直径最小（图1），且最稀疏。表明PDA培养基是很好的植物病原真菌通用培养基。

2.2 不同碳源和氮源对病原菌菌丝生长的影响

病原菌在试验所用的几种碳源条件下皆可生长，其中以在可溶性淀粉条件下生长最好，其次是葡萄糖，它们之间存在明显差异。氮源以尿素最佳，其次是硝酸铵，菌落直径差异明显。不加碳和氮元素明显影响菌丝生长（表2）。

2.3 不同pH对病原菌菌丝生长的影响

试验结果表明，病原菌在pH为4～10的条件下皆可生长，而以pH为7条件下生长的最好，偏酸或偏碱都会影响菌丝的生长（图2）。

2.4 光照、通气条件对菌丝生长影响以及菌丝致死温度

病菌在光/暗为12 h/12 h交替的条件下生长最好，菌落直径达（47.18±0.72） mm，其次是24 h/0 h光照，菌落直径为（38.96±0.47） mm，完全黑暗条件下生长最差，菌落直径仅为（28.97±0.72） mm。且三者之间差异明显。可见，昼夜光节律对病原菌生长最有利。

在培养皿封口与不封口条件下，生长速率分别为10.47、10.80 mm/d，菌丝生长速率无明显变化（P>0.05）。

经过40 ℃以上6个温度水浴处理菌饼10 min，只有40 ℃处理下的菌丝生长良好，能在PDA培养基上形成菌落，菌落直径为（35.1±3.9） mm，其余温度下均未能在PDA培养基上形成菌落。因此初步确定病原菌菌丝的致死温度为45 ℃。

2.5 不同药剂对病原菌的毒力

供试的9种农药对病原菌菌丝生长均有明显的抑制作用。其中以多菌灵和咪鲜胺效果最好，分别在1.000 mg/L和1.250 mg/L浓度下，抑菌率均达85.0%。但是将药剂分别稀释2倍和4倍后，咪鲜胺的抑菌率降低幅度较大（图3）。

多菌灵最低浓度0.250 0 mg/L时，抑菌率达到76.9%，EC50仅为8.78 mg/L，咪鲜胺的EC50为75.22 mg/L（表3）。代森锰锌对病原菌菌丝抑制率效果最差，在浓度为1.670 mg/L条件下，抑制率仅为40.8%，其EC50达2 621.71 mg/L。苯醚甲环唑在浓度为0.286 mg/L条件下，抑菌率达到80.3%，效果良好。由此可知，在9种常用药剂中，多菌灵对病原菌菌丝生长的抑制效果最好，咪鲜胺和苯醚甲环唑次之，代森锰锌效果最差。

3 小结与讨论

木瓜早期落叶主要由褐斑病（M. nacoronaria）和圆斑病（Phyllosticta solitaria）引起[8]。褐斑病在整个木瓜生长季节均有发生，尤以7～8月最为严重。发病初期叶片出现褐斑，随后逐渐扩大呈黑褐色斑，严重时布满整个叶面，直至叶片枯死脱落。该病害的发生严重影响木瓜的产量和品质。除云南之外，山东、安徽和湖北等省均有发生。该病菌也是导致苹果树早期落叶的主要病原，其有性态为苹果双壳菌（Diplocarpon mali）。目前该病已成为阻碍中国苹果产业健康发展的主要病害之一[16]。但目前为止还没有此病原物的生物学特性和药剂筛选的报道。

本研究测试了不同培养基、pH、光照、通气状况、碳源、氮源和温度等条件对病原菌菌丝生长的影响。结果表明，该病原菌在pH为4～10范围内均能生长，以pH 7生长最好；最适碳源为可溶性淀粉，氮源为尿素；在光暗交替的条件下菌落生长较好，最适培养基为PDA培养基。

室内药剂筛选研究了9种不同药剂不同用药量对菌丝生长的影响。结果表明，抑制病原菌菌丝生长的最佳药剂为多菌灵，EC50最小，在浓度为1.000 mg/L时，相对抑制率为85.0%。咪鲜胺1.250 mg/L浓度下，相对抑菌率为85.0%，但是将药剂分别稀释2倍和4倍后，效果不如前者。其次是10%苯醚甲环唑，在浓度为0.286 mg/L时，相对抑制率为80.3%，代森锰锌药剂的抑制效果不佳。所测试的农药有杀真菌剂、杀卵菌剂、杀细菌剂和昆虫生长调节剂，其对病原真菌均有一定的抑制作用。有报道称，咪鲜胺与多菌灵混用有显著的增效作用，因此药剂防治筛选还应考虑药剂混合后的防治效果。

试验对木瓜斑点落叶病的生物学特性和室内药剂筛选做了初步研究，为进一步认识该病原以及该病害的发生规律和防治奠定了一定基础。

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