微生物肥料对草莓根腐病防治效果及对根围土壤微生物群落多样性的影响

摘要 [目的]探究微生物施肥技术对草莓根腐病的防治效果，为进一步合理应用微生物肥料防治草莓重茬病害提供理论依据。[方法]在草莓生长期施用微生物肥料，于膨果期调查草莓根腐病发病情况，并采集土样提取土壤基因组DNA，通过PCR扩增建立文库，利用Miseq 平台Illumina 第二代高通量测序技术并结合相关生物信息学分析土壤细菌16S rRNA基因V3+V4 区域和真菌ITS1 区域的丰富度和多样性指数以及群落结构。[结果]微生物肥料可使草莓根腐病发病率降低36.3%，平均防效达63.9%;显著降低镰孢菌属的相对丰度，较对照区降低了97.56%，明显提高了有益细菌芽孢菌属的相对丰度，较对照区提高了30.37%。[结论]微生物肥料可有效改善土壤微生物区系并提高作物产量、改善草莓品质。

关键词 草莓根腐病;微生物肥料;微生物群落多样性

中图分类号 S144文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）33-0111-03

近年来，由于草莓市场需求逐年扩大，种植草莓的连作重茬地面积逐年增加，从而造成草莓根部病害逐年加重，其中草莓根部重要病害之一是草莓根腐病（strawberry root rot）。草莓根腐病是一种较典型的根部土壤传播病害，防治困难，特别是种植在连作多年草莓地块的草莓更容易发生草莓根腐病。轻则造成草莓产量下降，重则造成草莓绝收[1]。随着我国棚区草莓种植面积的逐年增加，草莓根腐病的发生也呈逐年上升趋势，已成为制约草莓产业正常发展的主要因素之一[2-3]。

在防治该病方面，农药等化学药剂的作用巨大，也显而易见，但长期频繁使用化学药剂也在很大程度上增强了病原菌的抗药性，从而使得化学药剂的防治效果越来越差[2]，且长期、大量、频繁地使用农药等化学药剂容易破坏整体生态平衡，引起各种环境污染，危害人类健康[1-2]。探寻一条新的途径来克服或缓解这些制约草莓生产的影响因素具有重要意义。

为此，笔者以常规施肥为对照，选取有代表性的草莓根腐病发病地块，研究“富思德”微生物肥料对草莓根腐病的防治效果以及对草莓根围土壤微生物群落多样性的影响，旨在为采用微生物肥料调节草莓的连作障碍防控技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

“富思德”荧光假单胞菌剂（领先生物农业股份有限公司）：有效活菌数≥5亿/mL;“富思德”生物有机肥（领先生物农业股份有限公司）：有效活菌数≥0.2亿/g，有机质≥40.0%。作物为连续种植6年棚的草莓，品种为红颜99。

1.2 试验设计

试验于2015年9月在秦皇岛昌黎左丰台草莓种植区进行。对照区为常规化学肥料，肥料用量（折合成纯养分）为N 330 kg/hm2 、P2O5 240 kg/hm2、K2O 560 kg/hm2。采用大區对比试验，各处理面积为667 m2，不设重复。试验设2个处理：以常规施肥作为对照区（CMB01）;微生物肥料（CMJ02）为处理区。定植前基施“富思德”生物有机肥2 250 kg/hm2;分别在草莓定植期、缓苗期、开花期、膨果期、第一次摘果期、第二次摘果期冲施“富思德”荧光假单胞菌剂75 L/hm2。草莓对照区及处理区各时期施肥及管理措施均为当地种植人员常规管理模式。

1.3 试验方法

1.3.1 发病率调查。

在草莓膨果期调查草莓根腐病发病情况，每个处理随机选取6行，每行10 m。发病率、病情指数和防效分别按照下列公式计算[4-7]。

发病率=死苗棵数/调查区间种植总棵数×100%

病情指数=[（病级株数×代表值）/（总株数×最高病级代表值）]×100

防效=（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数×100%

草莓根腐病发病程度参考[8-9]的方法分为6 级。0 级为根系未见发病;1 级为根系发病率≤30%，叶片较为正常;2 级为30%<根系发病率≤60%，叶片较为正常;3 级为60%<根系发病率≤80%，叶片已开始变黄;4 级为根系发病率80%以上，叶片已枯萎;5 级为整株死亡，叶片整体干枯。

1.3.2 根际土壤微生物多样性分析

1.3.2.1 土壤微生物DNA提取。

分别在盛果期取对照区及处理区草莓根际土样，采集时间为2016年4月，每个处理随机选取5个取样点，用螺旋取土钻采集0～10 cm表层新鲜土壤，除去杂物、根系，研磨并过2 mm筛后混合[10]。针对每种新鲜土壤，分别称取0.5 g，3个重复。用FastDNA Spin Kit for Soil 试剂盒（ MP Biomedicals）提取土壤微生物基因组总DNA[10]，将提取得到的土壤DNA溶解于50 μL TE 缓冲液，详细操作步骤参考试剂盒说明书。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，DNA 样品于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2.2 试验流程。

提取土壤样品总DNA后，根据文献[11]得到细菌V3+V4（F：5′-ARACTYCTACGGRAGGCWG-3′;R：5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′）和真菌ITS1（F：5′-AACCTGCGGAAGGATCATT-3′;R：5′-GARCCAAGAGATCCRTTG-3′）合成引物，PCR扩增并进行纯化、定量和均一化后建立测序文库，质检合格的文库用Illumina HiSeq PE250进行测序[12]，该测序工作由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。

1.3.3 产量及品质调查。

草莓盛果期分别调查对照区及处理区草莓产量（10 m）并测定草莓品质。品质测定按照下列方法[13]：选取50个成熟度较为一致的草莓果实，充分研碎后过滤得到滤液，采用苯酚硫酸法测定滤液中的可溶性糖含量[14];采用酸碱滴定法测定滤液中的可滴定酸含量;采用2，6-二氯靛酚滴定法测定滤液中的抗坏血酸含量[15]，重复3次。

2 结果与分析

2.1 微生物肥料对草莓根腐病防治效果的影响

在盛果期调查对照及处理区草莓根腐病发病情况及病情指数，结果见表1。由表1可知，在草莓整个生长期间施用微生物肥料，发病率降低了36.25%，平均防效达63.9%。说明在草莓整个生长期间施用微生物肥料能够很好地预防并降低草莓根腐病引起的死苗现象。

2.2 微生物肥料对根际土壤真菌和细菌相对丰度的影响

Ace和Chao指数可反映群落物种丰富度，Shannon指数反映群落多样性。不同处理下土壤样品群落丰富度和多样性指数见表2。由表2可知，施用微生物肥料的处理区土壤中真菌Ace指数、Chao指数和Shannon指数均有所下降，分别降低了5.58%、7.68%、20.97%，处理区土壤中细菌Ace和Chao指数也均有所下降，分别降低了2.92%、3.77%、5.28%。说明施用微生物肥料后均在一定程度上降低了草莓根际细菌、真菌的群落丰富度和多样性，但下降幅度不显著。

由图1A 可知，草莓对照及处理区根区土壤样品中的真菌中未确定种属的菌类占很大比例（对照区74.19%，处理区90.27%）外，镰孢菌属（Fusarium）、腐质霉属（Humicola）、毛癣菌属（Trichocladium）的相对丰度最高，属于优势真菌。施用微生物肥料可显著降低镰孢菌属的相对丰度，较对照区降低了97.56%，从而可以有效地降低草莓根腐病的发生。

由图1B可知，草莓对照及处理区土壤样品中的优势细菌为Gemmatimonadaceae_uncultured、芽孢菌属（Bacillus）、OPB35 soil group_norank、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、RB41_norank、Nitrosomonadaceae_uncultured。施用微生物肥料后可明显提高有益细菌芽孢菌属的相对丰度，较对照区提高了30.37%。

2.3 微生物肥料对草莓产量及品质的影响

由表3可知，微生物肥料的施用可显著提高草莓产量并改善草莓果实品质。微生物肥料可使草莓较对照增产25%，增产极显著（P<0.01）;草莓果实可滴定酸含量下降10.8%，维生素C含量提高6.94%，变化显著（P<0.05），而糖分含量增幅不显著（P>0.05）。

3 结论与讨论

研究表明，阻碍草莓连作的最主要因素是草莓的各种病害发病率急剧上升，从而导致植株长势不良、根系新生根生长受到明显限制，最终导致草莓产量和品质受到极大影响[16]。其根本原因是草莓根际土壤中的病原微生物数量急剧增加，从而导致有益微生物和病原微生物的比例严重失调，根系分泌出的自毒物质也出现大量累积[13，17-18]。研究表明，利用有益微生物可明显降低草莓连作中各种障碍的影响[19-20]。该试验利用微生物肥料可对草莓根腐病起到非常显著的防治效果，发病率降低36.3%，平均防效达63.9%;微生物肥料的施用显著降低了镰孢菌属的相对丰度，明显提高了有益细菌芽孢菌属的相对丰度，对草莓根际微生物区系起到明显的改善作用。

该研究表明，微生物肥料的施用可显著改善连作种植草莓地区草莓根际土壤微生物区系，促进草莓新生根系及植株健康生长，从而增强草莓自身抗病性，大大降低连作草莓根腐病发病率，提高草莓产量并改善果实品质，有效缓解了草莓连作障碍的影响。

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