甘草内生真菌的分离及产黄酮类化合物菌株的筛选

摘要：对甘草根、茎、叶中的内生真菌进行分离，并采用黄酮物质显色反应法对42株内生真菌的发酵液进行检测，结果显示，共得到菌株42株，其中26株分离自根，9株分离自茎，7株分离自叶。其中10株菌的显色反应呈阳性，说明能够产生黄酮类物质，这10株菌中，有7株来自根，1株来自茎，2株来自叶。进一步利用比色法对这10株菌发酵液中的总黄酮含量进行了测定，结果表明，菌株GF1—8、GF3—5、GF3—2有较高的黄酮产量，发酵液中总黄酮含量分别为0.138 mg · mL—1、0.125 mg · mL—1、0.102 mg · mL—1，3株菌均分离自根。

关键词：甘草；内生真菌；黄酮；分离；筛选

中图分类号：R284 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006—6500.2012.05.004

Isolation of Licorice Endophytic Fungi and Screening of Flavones—producing Strains

LI Yan—bin1，2， ZHANG Qin1，2

（1. College of Life Science， Tarim University， Alaer843300， China； 2. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources in Tarim Basin， Tarim University， Alar843300， China）

Abstract： Endophytic fungi were isolated from licorice root， stem and leaf， 42 strains were selected in total， 26 strains isolated from root and 9 from stem， 7 from leaf. The fermentation liquids of 42 endophytic fungi were examined by characteristic color reaction of flavones， the results showed that 10 strains showed positive color reaction， indicating the flavones—producing potential of the 10 strains， among the 10 strains， 7 isolated from root， 1 from stem， 2 from leaf. Then the total flavones concentration in fermentation liquids of the 10 strains were examined by spectrophotometry， the results showed that three strains numbered GF1—8， GF3—5， GF3—2， which all isolated from root， produced high yield of flavones， the flavones concentration in fermentation liquids of the three strains were 0.138 mg · mL—1， 0.125 mg · mL—1， 0.102 mg · mL—1 separately.

Key words： licorice； endophytic fungi； flavones； isolation； screening

甘草（Glycyrrhiza）属多年生豆科草本植物，是我国传统中药中最常用的草药之一，素有“国老”之誉。甘草黄酮是甘草重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等作用[1—4]，在医药保健、食品添加剂、化妆品等方面应用广泛。甘草主产于我国东北、华北、西北各干旱贫瘠地区，具有固沙绿化的重要作用，因此，甘草被政府列为保护药材，禁止滥挖。近年来人工种植甘草得到较快发展，但因其生长周期长、收益慢，仍不能满足市场对甘草药材的需求。

植物内生菌是指在其生活史中某一时期生活在健康植物组织内，但不引起植物产生病害症状的微生物，包括真菌、放线菌和细菌[5—6]。内生菌可以产生与宿主植物相同或相似的生理活性物质，自1993年Stierle等[7]从红豆杉中发现能产紫杉醇的内生真菌后，近些年相继有研究表明许多药用植物内生菌能够产生类似宿主植物药效成分的生物活性物质[8—11]，且主要以内生真菌为主[12]。与从植物中提取活性物质相比，微生物具有生长繁殖快，发酵成本低，易培养，易控制，不受气候与地域等自然条件的限制，易于通过现代生物技术改造遗传性状等优点，对保护药材资源和保证药物供应等有重要的意义。因此，植物内生菌已成为筛选与宿主相同或相似的有益代谢产物的研究热点。

已有研究表明，甘草中也有较为丰富的内生菌资源，但利用甘草内生菌生产活性产物仍缺乏系统的研究。本研究拟从甘草中大量分离内生真菌，并对其中能产黄酮类物质的菌株进行了初步筛选，以期为利用内生真菌发酵法生产甘草黄酮提供基础材料和科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

于2010─2011年不同季节在塔里木大学周围采集健康甘草植株，分根、茎、叶3部分用自来水清洗干净，晾干备用。

柚皮苷，购自美国Sigma公司。其余化学试剂均为国产分析纯。

1.2 培养基

内生真菌的分离用PDA琼脂培养基，发酵培养基用PDA液体培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 甘草内生真菌的分离 将洗净晾干的新鲜甘草植株根、茎、叶分别装入烧杯中，用2.5% NaClO分别将根、茎浸泡5 min，叶浸泡2 min，无菌水冲洗3次后再用75%乙醇分别浸泡5 min、1 min，再用无菌水冲洗3～4次，最后一次清洗的水涂布至牛肉膏蛋白胨培养基平板中检查表面消毒是否彻底。

经表面消毒的甘草根茎叶分别用无菌粉碎机粉碎，取少量均匀撒在分离培养基上，30 ℃培养箱中培养。每天进行观察，菌体长出后根据菌落及菌体形态以划线法转接至新鲜PDA培养基上进行纯化，最终得到纯培养菌株，在4 ℃下试管斜面保藏。

1.3.2 产黄酮内生真菌的筛选

（1） 液体发酵培养及检测样品制备

配制液体发酵培养基，按每瓶50 mL分装至150 mL三角瓶中，灭菌。将活化的菌种斜面用无菌水制成孢子悬液，调节孢子浓度为107 个·mL—1，按10%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中，放至摇床中，30 ℃、120 r · min—1发酵，各菌种5次重复。

3 d后终止发酵，将发酵液于6 000 r · min—1下离心15 min，除去沉淀，取上清液进行黄酮检测。

（2） 黄酮显色反应检测

盐酸—镁粉反应：取1 mL待测液至试管，加入少量镁粉，然后滴加浓盐酸3～4滴。

三氯化铁反应：取1 mL待测液至试管中，加入数滴2%的FeCl3溶液。

NaOH反应：取1 mL待测液至试管中，加入4%的NaOH溶液数滴。

显色反应的结果鉴别。

（3） 黄酮含量的比色法测定

采用比色法于415 nm下测定发酵液中的黄酮含量。参照文献[16]，取样品溶液0.5 mL加入10% KOH溶液0.5 mL，室温放置5 min，用甲醇稀释定容至10 mL。再取各样品溶液0.5 mL，直接用甲醇定容至10 mL作为空白对照，在415 nm下测定吸光度。

以柚皮苷为标准品，415 nm下测定吸光度。以吸光度值为横坐标，柚皮苷质量浓度（mg · mL—1）为纵坐标绘制标准曲线（图1）。得到回归方程：Y = 0.018 9X + 0.000 7，R2 = 0.998 9。其中，Y为黄酮含量（mg · mL—1），X为吸光度值。

2 结果与分析

2.1 甘草内生真菌的分离

从甘草的不同部位共分离出内生真菌42株，说明甘草中有着丰富的内生真菌资源。其中26株分离自根，9株分离自茎，7株分离自叶，说明在不同的组织部位，内生真菌分布情况是有较大差异的，甘草根中内生真菌的数量要远大于茎和叶。

2.2 甘草内生真菌发酵液显色反应结果

通过黄酮类化合物特征性的显色反应，对分离得到的甘草内生真菌发酵液逐一进行了筛选，结果表明，有20余株菌的NaOH反应呈阳性，其中有10株菌3种显色反应均呈阳性，且发酵液呈现不同程度的黄色，说明能够产生黄酮类物质。这10株菌中，有7株来自甘草根，1株来自茎，2株来自叶。从反应的颜色来分析，多数菌株产生的是黄酮，菌株2—2可能产生黄酮醇。

2.3 甘草内生真菌发酵液中总黄酮含量的检测

依照黄酮物质的比色测定法，于415 nm波长下分别对以上10株菌的发酵液进行测定，并以柚皮苷为标准品计算发酵液中总黄酮的含量

10株显色反应阳性菌株的发酵液中，均含有不同浓度的黄酮类物质，且含量均在0.01 mg · mL—1以上。其中菌株GF1—8、GF3—5、GF3—2有较高的黄酮产量，发酵液中总黄酮含量分别达到0.138 mg·mL—1、0.125 mg·mL—1、0.102 mg·mL—1，这3株菌均分离自根，根据菌落形态及显微观察，初步判断GF1—8、GF3—5可能为曲霉属，GF3—2为镰孢菌属。总体上来看，从根中分离的内生真菌产黄酮的能力较高，其次为茎中内生真菌，从叶中分离的菌株黄酮产量较低。

3 结论与讨论

依据内共生理论，与宿主共同进化的内生菌可能从宿主获得相关基因的直接传递，从而具有与宿主植物相同或相似的次生代谢产物合成途径。近年来国内外的陆续报道证实了这一观点，表明多种药用植物的内生菌均能产生与宿主相同或相似的活性成分，已成为寻找天然活性物质的重要来源。目前，人们分离出能产植物体活性物质类似物的内生菌大多数都是真菌。本研究表明，甘草中也有着十分丰富的内生真菌资源，不少能产生黄酮类物质，其中以从根中分离的菌株为主，茎与叶中较少。

微生物发酵生产天然活性物质具有生产速度快，发酵过程容易控制，易于实现工业化培养等优点。本试验结果为将来利用工业发酵法大量生产甘草黄酮类物质提供了菌种材料支持。但同时也可看出，未经菌种选育和发酵条件优化的内生菌代谢产物的产量一般都较低。因此，后续工作应在继续扩大内生真菌分离数量和种类的基础上，对所得到的优良菌株进行发酵工艺优化，并通过菌株生理特性研究、遗传特性改良等手段提高其黄酮产量，以最终实现甘草黄酮的微生物发酵生产。这对于有效地开发利用甘草内生菌资源，保护野生甘草资源及改良环境具有重要意义。

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