贵州西南喀斯特地区土壤芽孢杆菌资源及多样性研究

材料与方法

11试验材料

111土壤样品

选取贵州省兴义市坡岗、兴仁县清水河、安龙县青龙山三个喀斯特保护区采样点（参见表1），于保护区内不同海拔、不同生境下，采集地表以下5～10 cm的土壤，装入无菌密封袋，及时分离土壤芽孢杆菌。

112分离培养基分离培养基为牛肉膏蛋白胨培养基[3]。

113试剂芽孢杆菌基因组DNA提取采用BIOMIGA公司细菌基因组DNA提取试剂盒（GD2411 Bacterial gDNA Miniprep kit）。

12试验方法

121分离纯化分离纯化方法参照《微生物学实验》[3]。

122芽孢杆菌的分类鉴定

1221形态学观察和生理生化实验

形态学观察和生理生化试验方法参照《微生物学实验手册》[4]与Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology[5]。

122216SrRNA基因序列测定

PCR扩增引物为细菌16SrRNA基因扩增通用引物63F（CAGGCCTAACACATGCAAGTC，5’→3’）和1387R（GGGCGGWGTGTACAAGGC，5’→3’）[6]。

PCR反应体系为25 μl体系（参见表2），反应条件参见表3。

PCR产物由上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序，得到16SrRNA 基因序列。将序列于EzTaxon（wwwezbiocloudnet）进行比对，使用MEGA60软件构建各个保护区内分离所得芽孢杆菌的系统发育树。参数为：邻位相连法（Neighbor-joining）、Kimura2-Parameter Distance模型、重复取样自展值（Bootstrap）为1000[7]。

123芽孢杆菌种类优势度分析

参数：所在群落的所有芽孢杆菌的个体数之和（N）、芽孢杆菌i的个体数（Ni）；分析公式：di=Ni/N=pi。芽孢杆菌占总物种的百分比di≥10%为优势种，1%

124芽孢杆菌群落多样性分析

参数：所在群落的所有芽孢杆菌的菌株数之和（N）、种类数目（S）、种群优势度（d）、Margalef丰富度指数（R）、香农-维纳（Shannon-Wiener） 的多样性指数（H’）、Pielou均匀度指数（J）和Jaccard相似性指数（Cj）；各分析指数的公式如下：

Margalef丰富度指数：R=（S-1）/lnN；

Shannon-Wiener多样性指数：H’=-∑dilndi（i=1，2，3，…，n ）；[8]

Pielou均匀度指数：J=H’/lnS；[9]

Jaccard相似性指数：Cj=c/（a+b+c）。

式中a和b分别为两种生境地中芽孢杆菌的种数或属数，c为两种生境地中共有的芽孢杆菌种数或属数。Jaccard相似性指数（Cj）用于比较两个生境地中芽孢杆菌种类组成的相似程度，当000≤Cj<025时，表现为不相似；当025≤Cj<050時，表现为中等不相似；当050≤Cj<075时，表现为中等相似；当075≤Cj≤1时，表现为极相似。

2结果与分析

21分离纯化结果

于三个喀斯特保护区共采集土样54份，分离到细菌189株，通过芽孢染色及观察，初步确定芽孢杆菌129株（6825%）。

22芽孢杆菌的分类鉴定结果

结合部分生理生化试验结果（参见表4），根据16SrRNA基因序列分析，将129株芽孢杆菌鉴定为24个种，涉及3个属：分别为芽孢杆菌属（Bacillus）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）和短芽孢杆菌属（Brevibacillus）（参见表5）。

23各保护区芽孢杆菌分布概况及优势度分析

坡岗保护区内苏云金芽孢杆菌和短短芽孢杆菌属于优势种，并且短短芽孢杆菌为该地区特有菌种；该地区其他特有芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌、JH792233_s菌株、桥石短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌枯草亚种。

清水河保护区优势种为苏云金芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；该地区特有芽孢杆菌为病研所芽孢杆菌、解木糖赖氨酸芽孢杆菌、路西法芽孢杆菌和郭霍氏杆菌。

青龙山保护区优势种是苏云金芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、维德曼芽孢杆菌、高地芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌，其中蕈状芽孢杆菌为该地区特有菌种；该地区其他特有芽孢杆菌为单纯杆菌和弯曲芽孢杆菌。

三个保护区优势种为苏云金芽孢杆菌（2016%）、蜡样芽孢杆菌（1473%）和维德曼芽孢杆菌（1008%），芽孢杆菌属为优势属（9380%）。以上结果可以体现出贵州西南喀斯特地区生境下一定的芽孢杆菌资源及分布特点。具体参见表5。

24各保护区芽孢杆菌群落多样性分析

从图1（A， B）得出，清水河保护区数值皆最高，青龙山保护区R值最低，坡岗保护区H’值最低。表明清水河保护区土壤芽孢杆菌在种类数量方面和种属水平分布均匀度方面都具有优势，群落稳定性更加明显[10]。

从图1（C）得出，清水河保护区J值最高，坡岗保护区J值最低。表明清水河保护区土壤芽孢杆菌在种属间和种内分布都比较均匀。

坡岗与清水河之间的相似性指数Cj为02432，表现为不相似；坡岗与清水河之间的相似性指数Cj为01875，表现为不相似；清水河与青龙山之间的相似性指数Cj为02571，表现为中等不相似（参见表6）。

3讨论

土壤芽孢杆菌资源及多样性研究越来越受到专家学者的青睐。王子旋等对新疆不同地区的土壤芽孢杆菌种类及其多样性进行了调查， 结果显示新疆地区芽孢杆菌种类较丰富， 但在种类和数量上受空间分布影响[11]；刘国红等对玉米根际土壤的芽孢杆菌做了一定的研究，发现了芽孢杆菌与玉米根部之间的相关联系[12]；葛慈斌等首次调查了武夷山地衣表生和内生芽孢杆菌种类多样性，发现芽孢杆菌属为优势属，苏云金芽孢杆菌为优势种[13]。

在貴州西南部喀斯特地区土壤芽孢杆菌多样性方面，清水河保护区自然生境类型丰富，海拔地势低，气候湿润温热，人为活动影响小，参数相对较高；而坡岗保护区气候偏干燥，人为活动较频繁，参数相对较低。一定程度上反映出人为活动程度、湿度、海拔高度、生境种类、种群密度等环境因素会对土壤芽孢杆菌丰富度、多样性、分布均匀度等造成一定的影响，在人为活动程度小、湿度大、海拔低、生境类型丰富、种群密度适中的生境下，芽孢杆菌各种多样性指数相对更有优势。受人为活动因素影响较大的生境与自然生境在芽孢杆菌资源相似度方面有着较高的差异，自然生境间差异不显著。

苏云金芽孢杆菌是世界范围内应用最广泛的生防芽孢杆菌之一，在本次研究土壤中具有明显的优势度，同样，阿氏芽孢杆菌和短短芽孢杆菌也可应用于生防制剂的研发，可以为生防芽孢杆菌的开发和利用储备菌种，提升作物病虫害防治水平；高地芽孢杆菌因其具有脱氮除磷作用[14]，是一种良好的废水净化功能菌种，蕈状芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌等在污水处理的解磷、解氮和重金属离子吸附方面也有相关应用；维德曼芽孢杆菌是美国于2016年从乳制品分离出的一株新型耐冷、具有致病性的芽孢杆菌[15]，在喀斯特地区土壤中的报导尚属首次；菌种JH792383_s、菌种CM000739_s和菌种JH792233_s在菌种库中尚未有明确的芽孢杆菌命名，相关研究报导极少，具有较高的研究价值。

以上结果显示了该地区具有较丰富的土壤芽孢杆菌资源，并且其分布及多样性特征与当地生境之间存在一定的关联，可为研究贵州西南喀斯特地区芽孢杆菌特点提供相应的参考。

参考文献：

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[3]沈萍 微生物学实验第4版[M] 高等教育出版社，2007

[4]周德庆，编 微生物学实验手册[M] 上海科学技术出版社，1986

[5]Brenner D J，Krieg N R，Staley J T Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology[M] Williams & Wilkins*， 2005.

[6]Marchesi J R， Sato T， Weightman A J， et al Design and Evaluation of Useful Bacterium-Specific PCR Primers That， Amplify Genes Coding for Bacterial 16S rRNA[J]. Applied & Environmental Microbiology， 1998，64（2）：795.

[7]郑有坤，任丹，卢圣鄂，等 铅锌矿区蜈蚣草内生放线菌的多样性及群落结构[J] 环境科学学报，2014，34（11）：2832-2838.

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[11]王子旋，刘波，林营志，等 新疆土壤芽孢杆菌采集鉴定及其分布多样性[J] 福建农业学报，2012，27（2）：187-195.

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[13]葛慈斌，郑榕，刘波，等 武夷山自然保护区土壤可培养芽孢杆菌的物种多样性及分布[J] 生物多样性，2016，（10）：1164-1176.

[14]倪晋仁，邓若男 一株耐盐脱氮除磷高地芽孢杆菌其在废水处理中的应用：CN，CN102703350A[P] 2012

[15]Miller R A， Beno S M， Kent D J， et al Bacillus wiedmannii sp nov a psychrotolerant and cytotoxic Bacillus cereus group species isolated from dairy foods and dairy environments[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology， 2016， 66（11）.

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