沙门氏菌检测研究进展

【关键词】 沙门氏菌；检测

doi：103969/jissn1004-7484（s）201306736 文章编号：1004-7484（2013）-06-3418-02

沙门氏菌因美国病理学家DE沙门于1884年发现本属菌中的猪霍乱杆菌而得名。本属菌是一群抗原构造和生物学性状相似的革兰氏阴性杆菌。菌型繁多，已发现有2000种以上的血清型，我国已发现216个[1]。引起人类疾病的沙门氏菌大多属于A、B、C、D、E，5个血清群，病型有①伤寒与副伤寒（统称肠热症）：由伤寒沙门氏菌、甲型和乙型副伤寒沙门氏菌等引起；②食物中毒：可由不同菌型引起，以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、汤卜逊沙门氏菌等最为常见；③败血症：由猪霍乱沙门氏菌等引起，此外，还可引起慢性肠炎。人感染沙门氏菌后，可呈无症状带菌，也可表现为有临床症状的致死疾病，它可能加重病态或死亡率，严重威胁着人们的身体健康。为了有效预防沙门氏菌病，人们在探索沙门氏菌检测方法的过程中，做出了不懈的努力，特别是在免疫学、生物化学、分子生物学等方面，开发各种新型快速检测技术，提高了沙门氏菌检测的速度和质量，有效预防和控制沙门氏菌的传染。由于其样品来源极为繁杂，尽管各国学者对其进行了长期研究，仍存在不少问题。将有关检测进展综述如下：

1 传统的培养方法[2]

所有患者均在知情同意情况下进行腹水细菌阳性培养及药敏实验，抽取患者腹水时严格按照无菌操作进行，并将腹水接种到装有葡萄糖肉汤的培养试管中。对于培养结果为阳性的患者应转种到慷慨平板及血平板中，并将单个菌落分离鉴定。应用MIC法对革兰氏阳性菌及阴性菌进行鉴定。革兰氏阳性菌患者采用GP法鉴定进行药敏实验，革兰氏阴性菌患者应用GN021法进行药敏实验[2]。上述所有操作必需严格按照无菌操作以及试剂盒说明书进行。

2 免疫学方法

免疫学方法是以抗原和抗体的特异性结合反应为基础，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌，通过病原体刺激机体产生免疫球蛋白（抗体）的方法。

21 酶联免疫吸附试验上世纪80年代，随着单克隆抗体技术问世并日益成熟，抗沙门氏菌各种O抗原、H抗原单抗都随之建立起来，并取代了常规因子血清进行血清学鉴定、伤寒诊断，显示出单抗的优越性能。目前正在研制肠炎沙门氏菌特异性单克隆抗体Hgm，两株单抗联合使用将会更准确地检测肠炎沙门氏菌。文其乙等人在前人基础上应用沙门氏菌属特异性单克隆抗体CB8和de7建立了检测沙门氏菌的直接ELISA方法，并形成了快速检测试剂盒[3]。

22 斑点酶联免疫吸附试验斑点酶联免疫吸附（Dot-ELISA）试验是一项免疫学检测技术。桑杰等以硝酸纤维膜为固相载体，利用沙门氏菌多价血清和辣根过氧化物酶（HRP）标记制备的羊抗兔IgG，成功地建立对香肠的Dot-ELISA检查法，同时，采用常规分离培养鉴定技术作为对照试验。结果显示，在86份香肠中，用Dot-ELISA检出沙门氏菌阳性为36份，阳性率为4186%；而常规分离培养鉴定技术检出沙门氏菌阳性为34份，阳性率为3952%，经统计分析，t=0311，P﹥005，两种方法差异不具统计学意义[4]。

23 全自动荧光酶标免疫快速筛选法（mini-VIDAS快速筛选法）Mini-VIDAS快速筛选法是一套全自动食品致病菌检测方案。沙门氏菌的抗原鉴别是基于在VIDAS仪器内进行的酶联荧光免疫分析。沸煮一定的增菌肉汤，加入试剂条内，肉汤中的混合物在特定的时间内循环于SPR内外。沙门氏菌抗原存在则与包被在SPR内的单克隆抗体结合，碱性磷酸酶的抗体在SPR内外循环与结合在SPR内壁上的沙门氏菌抗原结合。废物-4-甲基伞形磷酸酮被SPR壁上的酶转化成荧光物-4甲基伞形酮。荧光强度由光学扫描器测定。试验结果由计算机自动分析。产生基于荧光测试的试验值与标准比较后打印出每一个被测样品的阳性或阴性结果报告。利用此方法进行沙门氏菌检测，只要增菌培养基，不需纯培养，增菌——上机后49h即可检测出结果。具有省时、方便、灵敏、假阳性少等特点[5]。

3 分子生物学方法

31 分离培养 ①取对数生长的沙门氏菌细胞，经消化后接种在预先放置盖有玻片的6孔板中；②待细胞生长成单层后将盖玻片取出，并采用PBS将细胞洗涤3次；③采用4%的多聚甲醛在4℃的温度下进行固定，并采用PBS溶液将细胞进行洗涤3次；④并在通透细胞膜中加入5%的Triton溶液浸泡15min，并采用PBS洗涤3次；⑤采用甲醇溶液将内源性过氧化物酶进行封闭，并于室温20℃采用PBS溶液将样本洗涤3次；⑥将含有二抗的正常动物血清放湿盒进行封闭，并于室温下20℃进行放置；⑦将悬浮液中加入羊抗人β波形蛋白单克隆抗体，并在37℃温度中将样本进行孵育2小时，并在4℃的冰箱中放置保存；⑧往样本溶液中加入生物素化二抗，并在室温下孵育15min，同时采用PBS溶液洗涤3次；⑨往样本溶液中加入过氧化物酶标链霉素，并在室温下孵育15min，同时采用PBS溶液洗涤3次；⑩往样本溶液中加入DBA显示剂对样本进行显色；○11采用自来水对样本进行洗涤，并采用苏木素对样本进行复染，进行封片，并在显微镜下观察样本细胞的情况。

32 转染 ①在转染前一天，将细胞消化并分别接种在6个孔板中，同时在浓度为5%的CO2溶液中将其孵化道培养箱中，当细胞铺满孔板约60%-80%时对样本进行转染；②转染方法按照生厂商提供实验方法进行操作；③将含有阴性荧光的Notch1100pmol中的Notch1转染培养后与含有5ug的脂质体的Notch1进行转染培养，并静置20min后将其制备为转染复合物；④将转染复合物加入到转染的培养基中，并加入转染培养基将每个孔的体积调至2000uL；⑤将样本溶液置于含有CO2的培养箱中进行孵化培养5-7h后，更换含有10%的胎牛血清以及双抗的DMEM/F12培养液中继续培养24h；⑥在荧光显微镜下观察细胞转染的情况，并根据转染率=荧光视野细胞数/明视野细胞数x100%，从而计算细胞转染率；⑦beta-catenin Notch1转染方法同上。

33 总RNA的提取 总RNA的提取方法如下：①当孔板长满细胞至85%-95%时，将上清液去除，并采用PBS将上清液漂洗2次；②在每孔中加入1mLTrizol试剂，并对样液进行摇匀，同时在无菌操作台上进行消化3-5min，直接细胞脱壁，样液粘稠为止；③在每个孔中将消化好的细胞裂解液吸收到处理过的15mL的EP试管中，并加入氯仿02mL，对样品液轻摇至15s；④将样本溶液于室温下静置3min后，将样本溶液置于4℃中进行离心15min；⑤取上清液置新的EP管中，并加入05mL的异丙醇，同时在室温下静置10min；⑥将样本溶液进行离心10min，直至见到RNA沉淀于EP管底内部；⑦将上清液弃置，并采用75%的乙醇将样本溶液进行洗涤，并在4℃中进行离心15min；⑧将上清液弃置，采用小Tip吸干液体，将沉淀物风干，并加入CEPC处理水，吹打均匀，并在水浴中将RNA溶解，测定OD值。

34 逆转录 按照RT试剂盒的操作经逆转录获取cDNA，具体方法如下：①准备EP试管065mL。②冰上操作：往EP管中加入10uL的DEPC水，1uL的引物，总RNA含量为1UL，并进行短暂离心。③将样本置于65℃的水浴中加热5min，并立刻置于冰上。④反应体系：含有4uL的5x RT Buffer，1uL RNA，2uL的10mMdNTP，10uL RNase free H2O，1uL 浓度为10U/uL的Rnase inhibitor，1uL的ReverTra Ace，总体系溶液为20uL。⑤反应条件：在42℃中反应20min；95℃中反应5min，在4℃中反应5min。⑥将样本置于cDNA在温度为﹣20℃中进行保存。

35 将变性蛋白样品进行SDS﹣PAGE电泳 ①清洗玻璃板；②灌胶：将凝胶充分聚合后，拔出加样孔；③加入适量电泳缓冲液，并提取蛋白样本100ug，小心加入样孔中；④浓缩凝胶以60V进行电泳30min，分离胶则以100V进行电泳90min，并以蛋白marker条带进行分开，采用溴酚蓝结束电泳时间；⑤转膜：取与凝胶面积大小相当的醋酸纤维膜用甲醛进行浸泡5min，并置于转膜缓冲液中制备备用，按照3层滤纸，按照醋酸纤维素滤膜、凝胶、3层滤纸的顺序逐张进行叠放，在凝胶上面合上夹子，讲气泡赶走，并将其置于预冷转膜槽中，给予足量的转膜缓冲溶液，并以200mA的电流进行电泳；⑥免疫反应：采用TBST膜置于5%脱脂牛奶进行封闭，并在温室摇床中摇匀1小时。分别加入beta-catinen、MMP﹣9单克隆抗体，并在4℃中孵化过夜，并在常温下对样本进行脱色，置于摇床中进行摇匀，并采用TBST进行洗涤3次，每次洗涤时间为10min。加入辣根过氧化物酶标鼠抗羊二抗，并在室温下孵育1小时，置于摇床中进行摇匀，并采用TBST进行洗涤3次，每次洗涤时间为10min；⑦曝光处理：采用ECL发光试剂盒对样本进行化学荧光反应，并在暗室环境中压片5min，加入显影液，定影液3min；将胶片进行拍照及扫描，净光密度值采用凝胶图像处理系统进行分析。

参考文献

[1] 王秀茹预防医学微生物学及检验技术[M]北京：人民卫生出版社，2002309-318

[2] GB /T47894 – 2008食品卫生微生物学检验-沙门氏菌检验[S]

[3] 文其乙，焦心安直接 ELISA 检测沙门氏菌方法的建立及其应用研究[J]中国兽医学报，1995，15（2）：105-111

[4] 桑杰，史小为Dot-ELISA 检查香肠中沙门氏菌的研究[J]草业与畜牧，2007，（03）：6-8

[5] 付丽红，王晓闻酶联免疫吸附法在沙门氏菌检测中的研究进展[J]中国酿造，2009（1）：6-8

[6] 王晶，王林，黄晓蓉主编食品中沙门氏菌的快速筛选法[A]食品安全快速检测技术[M]北京：化学工业出版社，200210：138-144

[7] 杨平，杨迎伍，陈伟，等食品中四种致病微生物的多重 PCR 快速检测技术研究[J]西南大学学报（自然科学版），2008，29（5）：90-94

[8] 陈弟事，郭万柱，徐志文，等猪霍乱沙门氏菌的分离与鉴定以及 PCR 检测方法的建立[J]安徽农业科学，2007，35（20）：6020-6023

[9] 李光伟，邱杨，肖性龙，等沙门氏菌荧光实时定量PCR 检测试剂的研制和应用[J]微生物学通报，2007，34（3）：496-499

[10] H irose K，Itoh KI，N akajim a H，et alSelective amplification of lyv（rfbE），pa（rfbS），viaB，and flie genes by multiplex PCR for identification of salmonella enter case rovars typhi and paratyphiA[J]JC lin Microbiol，2002，（40）：633-636

[11] Cocolin L，Man zanoM，AstoriG，et alA highly sensitive and fast no radio active method for the detection of polymerase chain reaction products from salmonella serovars，such as salmonella typhi in blood specimens[J]Immanuel Med Microbial，1998，22（3）：233-239

[12] Baumler A J，H effron F，Reissb rod t RRapid detection of salmonella enteric a with primers specific for iro B[J]JM icrobiol，1997，（35）：1224-1230

[13] C alva E，Ordonez L G，Fen andezMora M，et alDistinctive IS200 inscrtion between gyrA and resC genes in salmonella typhi[J]J Clin Microbiol，1997，35：3048-3053

[14] D avidW，Jane T，S ion PGDetection of PCR products using self probing amp icons and f fluorescence[J]Nature Biotechnology，1999，（17）：804-807

[15] 谢晓东，蒋蓉芳，宋伟民蝎形引物PCR 快速检测环境水样中沙门氏菌[J]环境与职业医学，2003，20（2）：115-119

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