丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析

［摘要］　目的：建立起丹参的转基因毛状根诱导及离体培养体系。方法：考察了不同外植体、不同农杆菌侵染时间和共培养时间诱导丹参毛状根的效率，共培养外植体用400　g·L-1　Cef水除菌5　min，接种在MS+400　g·L-1　Cef+2.5　g·L-1　Hyg的固体培养基上，完全除菌后转接入6，7V+2.5　g·L-1　Hyg液体培养基继代培养，GFP荧光检测阳性毛状根，PCR检测农杆菌特征基因rolC，并测定不同生长时期的毛状根干重和二氢丹参酮I的积累。　结果：用丹参叶片基部诱导毛状根，成功率可达到93.3%；农杆菌侵染10　min诱导效率最高为63.3%；共培养2～3　d诱导效果最好；PCR结合GFP荧光检测的方法鉴定阳性转基因材料具有较高的可信性；丹参毛状根生物量变化与次生代谢物积累之间有着紧密联系。结论：成功建立起丹参转基因毛状根离体培养体系，为进一步的基因工程应用打下基础。

［关键词］　丹参；毛状根；转基因；离体培养

［稿件编号］　20120330008

［基金项目］　国家自然科学基金项目（81072990，30901965）

［通信作者］　*黄璐琦，研究员，Tel：　（010）640144112955，Email：　huangluqi@263net 唇形科植物丹参Salvia　miltiorrhiza　Bunge是治疗心血管系统疾病的临床常用中药，主要含有2种有效成分，脂溶性的二萜醌类化合物和水溶性的酚酸类化合物，具有抗菌消炎、抗血栓形成、抗心肌缺血、保肝及抗氧化的作用[1]，有着广阔的应用前景。但由于丹参野生资源有限，有效成分在原植物根中含量低、生长周期长等原因，原料药的供应在数量和质量上都不能满足临床应用的需求[2]。

利用生物技术方法获得有用的次生代谢产物是药用植物代谢工程的一个重要手段。由发根农杆菌Agrobacterium　rhizogenes感染植物形成的毛状根系统，生长速度快、周期短、遗传稳定，不需要外源植物激素，合成次生代谢物质能力强，成为生产药用成分的良好培养系统[3]，尤其对于根类药材的药用成分积累有着广泛应用，如人参Panax　ginseng[4]、萝芙木Rauvolfia　verticillata[5]、朝鲜当归Angelica　gigas[6]等。然而，毛状根中次生代谢物含量通常较低，积累丹参有效成分特别是丹参酮类成分的能力一直无法达到生药水平[7]。一些研究中应用诱导子银离子（Ag+）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）等刺激某些次生代谢物积累，但诱导效果不稳定，且诱导机制不明，制约其发展。进行代谢途径改良，建立稳定高产的毛状根株系是药用植物次生代谢工程的一种有效工具。如在莨菪中共转化1，4丁二胺氮甲基转移酶基因和莨菪碱6β羟化酶基因，使转基因莨菪发根中东莨菪碱含量（411　g·L-1）比野生型（43　g·L-1）提高了9　倍，大大提高了莨菪烷类生物碱的合成与积累[8]。项目组通过前期的转录组学研究，积累了大量的关键酶基因，为针对丹参毛状根代谢途径进行遗传改造，在本研究中，利用含有绿色荧光过表达载体pH7WG2D的发根农杆菌Accc10060侵染丹参叶片产生毛状根，成功建立起适合丹参转基因毛状根离体生长的稳定转基因体系，为应用次生代谢工程手段提高其有效成分含量，促进产业化发展和应用奠定基础。

1　材料和方法

1.1　试剂

植物基因组DNA提取试剂盒（天根），MS培养基，6，7V培养基，头孢霉素，利福平，壮观霉素，潮霉素，过表达空载体pH7WG2D（Gateway，Invitrogen），ExTaq（TaKaRa），倒置荧光显微镜，PCR扩增仪，Accc10060农杆菌菌株由中科院植物所漆小泉课题组惠赠，二氢丹参酮I购自江西本草天工科技有限责任公司。

1.2　丹参外植体培养

陕西商洛天士力药材基地丹参种子，经本实验室郝近大研究员鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参S　miltiorrhiza。挑选饱满无破损的丹参种子用自来水冲洗30　min后用无菌水漂洗3次，吸干水分用75%乙醇浸泡45　s，0.01%升汞溶液浸泡10　min，无菌水冲洗4～5次，接种至MS固体培养基上，（25±2）　℃下暗培养3　d，未染菌的种子转至光照培养1周后可得到无菌幼苗，继续光照培养15～20　d，得到无菌植株，备用。

1.3　农杆菌的活化扩增

过表达载体质粒转化Accc10060菌株，PCR及测序验证正确的阳性克隆转接于1　mL新的含有50　mg·L-1　Rif和80　mg·L-1　Spe的YEB液体培养基中，28　℃，220　r·min-1活化过夜，以1∶50的比例转接于15　mL含有相同抗生素的YEB液体培养基中扩大培养，28　℃，220　r·min-1振荡培养至A600　0.5左右，将菌液倒入无菌离心管中，4　℃　4　000　r·min-1离心10　min，弃上清夜，用等体积的MS液体培养基重悬沉淀菌体，备用。

1.4　毛状根诱导及选择培养

选取幼嫩的丹参无菌苗，将叶片剪成0.5　cm×0.5　cm的小块，茎段切成0.5　cm长，并用刀片将叶片和茎段表面轻轻划伤，将外植体背面向上置于MS固体培养基上，每种材料接种30个，25　℃黑暗中预培养2　d。将同种预培养材料放入MS重悬液的三角瓶中，分别浸染0，5，10，15，20　min，考察侵染时间对诱导效率的影响。取出外植体，用无菌滤纸吸去菌液，放入新的MS固体培养基上，黑暗中共培养0，1，2，3，4　d，考察不同的共培养时间对诱导效率的影响。每个时间点均取30个外植体。将共培养的外植体用无菌水清洗3次，400　mg·L-1　Cef水浸泡5　min左右，无菌水洗1次，吸干水分后移入含400　mg·L-1　Cef和2.5　mg·L-1Hyg的MS固体培养基上，于黑暗中进行筛选培养，每7　d更换1次培养基。长至20～30　cm的抗性毛状根，切下单独标号继代培养，多次继代直至完全除菌后将阳性根转入只含有Hyg的MS固体培养基。30　d　后统计毛状根数并计算诱导率。

1.5　转基因毛状根的GFP鉴定和PCR鉴定

将含毛状根的培养皿放在倒置荧光显微镜下，在蓝色激发光源下观察。

取丹参新鲜叶片和毛状根各0.1　g，用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，纯化后作为PCR扩增模板。根据已发表的序列设计Ri质粒中rolC基因的PCR引物。扩增体系：　DNA　50　ng，10×缓冲液（含MgCl2）　2.5　μL，PF和PR　引物（均为10　μmol·L-1）　各0.　5　μL，Taq酶0.　3　μL，dNTP（10　mmol·L-1）2　μL，加水至25　μL。反应条件：　94　℃预变性4　min；　94　℃　变性30　s，55　℃退火30　s，72　℃　延伸1　min，30　个循环；　72　℃　10　min。琼脂糖凝胶电泳分离扩增后产物进行染色分析。以丹参叶片DNA为阴性对照（NC），以非转基因丹参毛状根作为阳性对照（WT）。

1.6　转基因毛状根生长曲线及丹参酮类物质积累

经过上述筛选的阳性毛状根在长至5　cm后，移入含有2.5　mg·L-1　Hyg的6，7V液体培养基中，25　℃　110　r·min-1暗培养。取同一株系生长旺盛的丹参转基因毛状根1　g鲜重（FW），无菌条件下接种至100　mL三角瓶中（50　mL培养液/瓶），共计15瓶，从继代培养第20天开始，每隔10　d　取出毛状根在37　℃培养箱干燥48　h至恒重后测定干重（DW），每次取3瓶，计算平均值，绘制生长曲线。

精确称取干燥至恒重的毛状根50　mg于2　mL的EP管中，加入两颗甲醇浸泡过夜的磁珠，球磨机研磨45　s，加入1.5　mL　MeOH，25　℃超声45　min，补足体积至2　mL，1万　r·min-1离心1　min，取上清，过0.45　μm　微孔滤膜，用于HPLC含量测定。二氢丹参酮I的含量测定方法参照梁宗锁等[9]方法。

2　结果与讨论

2.1　不同诱导条件对诱导效率的影响

2.1.1　不同外植体的影响　结果表明，相同条件下，不同外植体诱导效果不同。叶片基部诱导效率最高，可以达到93.3%，此部位叶脉较粗，传递和运输作用较强，对于农杆菌的侵染敏感度较高。非叶片基部和茎段也可诱导产生毛状根，但诱导效率明显不如叶片基部，分别为43.3%，73.3%（表1）。不同外植体上毛状根产生的时间也不同，叶片基部在暗培养15　d左右，可见白色毛根长出，茎段其次，一般需要20～30　d，叶片边缘时间最长，产生的毛状根也最少（图1）。

a叶片基部用于丹参毛状根诱导效果较好；b，c单独标号继代培养的毛状根；d摇瓶中继代培养的毛状根在20，30，40，50，60　d时的生长状态。

2.1.2　侵染时间的影响　外植体在农杆菌液中侵染10　min可达到最佳诱导效果，诱导率63.3%，随着时间延长，诱导率逐渐下降，侵染20　min时仅为13.3%。菌液浓度直接影响着农杆菌侵染效率，浓度越大，侵染时间越长，菌液与外植体接触面积越大，农杆菌中的Ri质粒更易进入外植体内，但菌液浓度过高也会导致农杆菌对外植体的过度伤害致死，或后期不能完全除菌，农杆菌过度增殖抑制毛根的产生（表2）。

2.1.3　共培养时间的影响　不经共培养的外植体诱导生根率为0，随着共培养时间延长，诱导率逐渐提高，共培养2～3　d诱导率分别达到567%，467%，继续培养则诱导率显著下降。共培养是为了诱导农杆菌中vir基因的表达，将其携带的外源基因转化进入外植体的过程[10]，共培养时间过长农杆菌增殖严重，毒害外植体，不利于发根长出，时间过短则转化效率降低（表3）。

2.2　转基因根系的建立

2.2.1　转基因毛状根GFP荧光检测　潮霉素抗性平板生长起来的毛状根，经GFP荧光检测转化率可达到887%。过表达载体pH7WG2D中含有加强型绿色荧光蛋白（Egfp）编码基因，这是一个可见的非破坏性标签，可由蓝色光（450～490　nm）激发下发射出稳定的绿色荧光（520　nm）（图2），是目前应用非常广泛的细胞内蛋白质定位和示踪分子之一，在转基因丹参毛状根中，可以应用这一标签对转化株系进行鉴定。

2.22　PCR检测结果　rol基因是控制毛根形成的基因，在不同类型的Ri质粒中均有存在[1112]，可以作为鉴定农杆菌的特征性片段。PCR鉴定结果表明，空载体转化株系与野生型毛状根均出现了预期条带（540　bp），而叶片DNA中未扩增出rolC片段，初步说明TDNA已经整合至丹参毛状根基因组内（图3）。

MDNA相对分子质量；NC丹参叶片DNA；WT不含质粒的农杆菌介导的毛状根；1，2，3，4转基因毛状根株系；　rolC农杆菌特征基因。

Fig3　PCR　identification　of　transgenic　hairy　roots　of　Salvia　miltiorrhiza

2.3　毛状根生物量与二氢丹参酮含量

对培养50　d的野生型和转基因株系中二氢丹参酮I含量检测结果表明（表4），不同根系中二氢丹参酮I含量差别显著，含量最低的WT1株系仅为1.89　mg·g-1，最高的V3株系达到3.77　mg·g-1；相同接种量的毛状根收获时生物量也不同，最重的WT3株系在50　mL培养体系中生物量为0.68　g（干重，DW），说明每一条毛状根都是一个独立的转化体系，不同根系生长差异显著，但野生型与转基因毛状根株系相比没有显著性差异。

Table　4　DyhdrotanshinoneI　content，biomass　and　yield　of　hairy　roots　after　subcultured　for　50　d（±s，n=3）

丹参毛状根生物量的积累是一个动态过程，以V3转基因根系为例（图4），继代培养40　d以内生物量迅速积累，毛状根由白色逐渐变成黄色、深黄色（图1），40　d以后丹参毛状根增殖速率减慢，开始进入次生代谢物积累阶段，毛状根颜色进一步加深，呈现出红黄色、红色以及粗壮的表型；60　d时虽然毛根生物量的绝对值有所增加，但生长速率更慢，有些毛根开始变成黄褐色，甚至发黑、老化。因此，丹参毛状根的继代培养周期应在40　d以内，以维持毛状根生长所需养分，改善生长环境。

3　讨论

目前，萜类代谢工程研究已经取得了长足进步。大肠杆菌和酵母以其生长迅速、基因操作相对简单等优势已经取得了较大进展，如在大肠杆菌中过表达DXP途径上的关键酶基因，提高类胡萝卜素含量[13]；导入可生成GPP和GGPP的操纵子后，番茄红素的产量提高到原来的6倍[14]；在酵母中导入截短后的HMGCoA还原酶基因，引起固醇合成前体鲨烯类物质的大量生成[15]等。在高等植物中导入外源基因作为重要萜类的生源研究也取得了一些成功的例子，如将来源于藻类的编码β类胡萝卜素的酮酶cDNA与烟草Pds启动子融合和转入烟草，可检测到虾青素[16]；将柠檬中的单萜合酶转入烟草，提高了烟草中的单萜产量，并改变了烟草中单萜成分的组成[17]。本文建立的转基因丹参毛状根体系，能有效用于解析丹参中有效成分的生物合成，同时为其工业化生产打下基础。

［参考文献］

[1]　任德成，杜冠华，张均甜　总丹酚酸对脑缺血再灌注损伤的保护作用[J]　中国药理学通报，2002，18（2）：　221

[2]　邱德友，宋经元，马小军，等　丹参毛状根生物反应器大规模培养的研究[J]　分子植物育种，2004，2（5）：　703

[3]　陈秀清　发根农杆菌诱导毛状根研究进展　[J]　安徽农业科学，2011，39（16）：　9514

[4]　刘峻，丁家宜，徐红，等　Ri质粒人参转化系统的建立及鉴定[J]　中国中药杂志，2001，26（2）：　99

[5]　孙敏，汤绍虎　转化毛状根获得萝芙木生物碱的研究[J]　生物工程学报，1993，9（3）：　290.

[6]　Rhee　H　S，Cho　H　W，Son　S　Y，et　al　Enhanced　accumulation　of　decursin　and　decursinol　angelate　in　root　cultures　and　intact　roots　of　Angelica　gigas　Nakai　following　elicitation　[J]　Plant　Cell　Tiss　Organ　Cult，2010，101：　302

[7]　Chen　H，Chen　F　Induction　of　phytoalexin　formation　in　crown　gall　and　hairy　root　culture　of　Salvia　miltiorrhiza　by　methyl　viologen　[J]　Biotechnol　Lett，2000，22（8）：　715

[8]　Zhang　L，Ding　R，Chai　Y，et　al　Engineering　tropane　biosynthetic　pathway　in　Hyoscyamus　niger　hairy　root　cultures　[J]　Proc　Natl　Acad　Sci　USA，2004，101（17）：　6791

[9]　张顺仓，刘岩，沈双，等　诱导子对丹参毛状根酚酸类和丹参酮类成分积累的影响[J]　中国中药杂志，2011，36（10）：　1274

[10]　曹冬梅，韩振海，许雪峰　发根农杆菌Ri质粒研究进展　[J]　中国生物工程杂志，2003，23（2）：　78

[11]　Michael　T，Spena　AThe　plant　oncogene　rolA，B　and　C　from　Agrobacterium　rhizogenes；　effects　on　morphology，development，　and　hormone　metabolism[J]　Methods　Mol　Biol，1995，44：　222

[12]　Kiyokawa　S，Kobayashi　K，Kikuchi　Y，et　al　Rootinducing　region　of　mikimopine　type　Ri　plasmid　pRi1724[J]　Plant　Physiol，1994，104：　802

[13]　Matthews　P　D，Wurtzel　E　T　Metabolic　engineering　of　carotenoid　accumulation　in　Escherichia　coli　by　modulation　of　the　isoprenoid　precursor　pool　with　expression　of　deoxyxylulose　phosphate　synthase[J]　Appl　Microbiol　Biotechnol，2000，53（4）：　400.

[14]　Reiling　K　K，Yoshikuni　Y，Martin　V　J，et　al　Mono　and　diterpene　production　in　Escherichia　coli　[J]　Biotechnol　Bioeng，2004，87（2）：　212

[15]　Polakowski　T，Stahl　U，Lang　C　Overexpression　of　a　cytosolic　hydroxymethylglutarylCoA　reductase　leads　to　squalene　accumulation　in　yeast　[J]　Appl　Microbiol　Biotechnol，1998，49（1）：　71

[16]　Wallaart　T　E，Bouwmeester　H　J，Hille　J，et　al　Amorpha4，11diene　synthase：　cloning　and　functional　expression　of　a　key　enzyme　in　the　biosynthetic　pathway　of　the　novel　antimalarial　drug　artemisinin　[J]　Planta，2001，212（3）：　465

[17]　L　Cker　J，Schwab　W，Hautum　B　V，et　al　Increased　and　altered　fragrance　of　tobacco　plants　after　metabolic　engineering　using　three　monoterpene　synthases　from　lemon　[J]　Plant　Physiol，2004，134（1）：　519

［责任编辑　吕冬梅］

推荐访问： 丹参 转基因 培养 体系 建立