摘要：选择标记基因（Selectablemarkergenes，SMGs）为目前应用体细胞核移植技术制备转基因家畜所必须。然而一旦完成筛选得到所需要的转化细胞或完成转基因动物的构建之后，SMGs就变成不需要的或多余的，而且这些带有标记基因的家畜还存在安全方面的隐患。因此，建立无选择标记的转基因家畜技术势在必行。目前能够采取的策略一是在筛选转化细胞或构建成功目的基因表达的家畜之后，删除SMGs;二是使用无筛选标记的转基因技术。综述了应用Cre/LoxP位点特异性重组系统删除SMGs的各种方法，以及应用锌指核酸酶（ZFNs）、TALEN和CRISPR/Cas9等新型基因编辑技术，基于受精卵显微注射的无筛选标记转基因技术的研究进展，分析对于制备无SMGs的转基因家畜而言后者的优势所在，旨在为转基因家畜研究提供参考。
关键词：转基因家畜;选择标记;基因删除
中图分类号：S185;Q789文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）21-5057-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.001
PreparingTransgenicLivestocksWithoutSelectableMarker
WEIQing-xin，BIYan-zhen，ZHENGXin-min
（HubeiAcademyofAgricultureScience/HubeiKeyLabofAnimalEmbryoandMolecularBreeding，Wuhan430064，China）
Abstract：Selectablemarkergenes（SMGs）arenecessaryforproducingtransgeniclivestockbytransferringnuclearofsomaticcellcurrently.SMGswillbecomeunnecessary，redundantorevenhiddendangerafterobtainingtransgeniccellsoranimal.Theestablishmentofmarker-freetransgeniclivestocksisimperative.Therearetwostrategiescurrently.Oneistoremovemarkerafterscreeningtransformedcellsorbuildinggenelivestocksexpressionsuccessfully.Anotherisusingnon-selectivemarkertransgenictechnology.MethodsaboutusingCre/LoxPsite-specificrecombinationsystemtoremoveSMGs，applyingnewgeneeditingtechnologiesincludingzincfingernuclease（ZFNs），TALENandCRISPR/Cas9，microinjectionwithmarkerfreetransgenictechnology，andtheadvantagesofbuildingtransgeniclivestockswithoutSMGswerereviewed.Itwillprovidereferenceforfutherstudyingthetransgeniclivestocks.
Keywords：transgeniclivestock;selectablemarker;generemove
先期的家畜转基因技术（如显微注射、精子介导和病毒感染等方法）是依靠分子生物学技术在个体水平或胚胎水平上进行筛选，因而不需要在转化载体中设置选择标记。但这些方法不仅效率低，而且外源基因是随机整合的，病毒感染法还存在载体安全隐患。体细胞核移植技术的出现，使家畜的转基因从随机整合发展到靶向修饰，规避了随机整合所带来的非预期效应和不确定性，能有效地实行外源基因的定位整合、基因敲除和其他定向的遗传修饰，成为目前制备转基因家畜的主流方法之一。然而这种方法需要对转化的细胞进行筛选，这就必须引进选择标记基因。
选择标记基因（Selectable marker genes， SMGs）可分为两类：一类是指其编码产物能够使转化的细胞具有对抗生素的抗性，在培养基中加入抗生素等选择试剂，非转化的细胞死亡或生长受到抑制，而转化的细胞能够继续存活，从而将转化的细胞从大量的细胞中筛选出来的一类基因。构建转基因动物常用的这类标记基因有 kan（卡那霉素）、amp（氨苄青霉素）、neo（氨基糖苷磷酸转移酶基因）、tk（胸腺嘧啶激酶基因）等。另一类也称报告基因（Reporter gene），是指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。目前转基因动物常用的报告基因是GFP（绿色荧光蛋白基因），由GFP衍生出来的还有BFP（蓝色荧光蛋白基因）、YFP（黄色荧光蛋白基因）等各种可视光的荧光蛋白基因。一旦完成筛选得到所需要的转化细胞或完成转基因动物的构建之后，SMGs就变成不需要的和多余的[1]，而且这些带有标记基因的动物还存在安全方面的隐患：①当人们食用了转基因动物的产品，SMGs编码蛋白有可能被转移到人体的细胞或肠道微生物中，从而可能会降低抗生素在临床治疗中的有效性;②SMGs编码蛋白是否会成为新的致敏原，尚不得而知;③报告基因的存在会让消费者产生一种心理排斥反应;④有研究表明，绿色荧光蛋白转基因小鼠与对照组比较，体重和摄食量明显降低，部分脏器（肝脏、胸腺）发育不良，不排除外源GFP基因对动物发育存在一定毒性[2]。
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