微生物来源溶栓酶的研究进展

摘要：血栓是心血管疾病的主要成因之一，纤维蛋白是血栓的主要蛋白成分，常用溶栓药物主要是各类溶解纤维蛋白的纤溶酶。本文综述了目前各类微生物中发现的溶栓类物质及其研究进展。

关键词：微生物；血栓；溶栓药物

心肌梗死、动静脉血栓栓塞等心血管疾病是造成全球人口死亡的主要原因之一。目前临床上使用的溶栓药物主要是组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶等纤溶酶原激活剂。尽管应用广泛，这些药物价格昂贵、对纤维蛋白的特异性较低、出血危险等限制了这些药物的使用，因此有待开发更为理想的溶栓药物。微生物是溶栓药物的重要来源，其种类繁多、代谢产物多样化、生长周期短、生产成本低等特点，为筛选新型溶栓活性物质提供了丰富的资源。

1 几种重要的微生物源溶栓药物

1.1链激酶 1949年研究人员从β-溶血链球菌的发酵产物中发现链激酶（Streptokinase， SK），其分子量为47kD，由414个氨基酸组成，是最早应用于临床的溶栓类药物。SK通过与纤溶酶原以1：1的比例结合成SK-纤溶酶原复合物，然后暴露活化位点，激活纤溶酶原成为纤溶酶，从而进行血栓溶解。临床应用表明SK有效且冠状脉开通率高，但因具有天然的抗原性而时有严重的免疫反应发生，且极短的半衰期极大的影响药效作用的发挥。

1.2 葡激酶 葡激酶（Staphylokinase， SaK）是由溶源性金黄色葡萄球菌分泌产生的一种由四种纤溶酶原激活因子构成的蛋白质家族，分子量均为16.5kD。SaK在血浆中同样是与纤溶酶原形成复合物，激活纤溶酶原成为纤溶酶并溶解血栓。大量动物血栓模型实验显示， SaK溶解动脉血栓的效果要明显优于SK。SaK具有极强的纤维蛋白特异性，当无纤维蛋白或血栓时，SaK-纤溶酶原复合物很快被2-抗纤溶酶灭活而不激活纤溶系统。虽然到目前为止尚未见SaK引起过敏反应的报道， 但SaK来源于细菌，仍然有着潜在的免疫原性。

1.3纳豆激酶 纳豆激酶（Nattokinase， NK）是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，由Sumi等在1987年发现。NK的分子量为27.7kD，在pH6～12.5的范围内稳定，热稳定性好，甚至在酸性环境下酶活也不会完全丧失，并已经从枯草杆菌中获得了其基因aprN。在临床实验中，口服NK胶囊能明显缩短优球蛋白溶解时间。NK具有纤溶活性外，还纤溶酶原激活剂，对交联纤维蛋白有很强的水解活性，但对纤维蛋白原却并不敏感，所以不易引起出血。基于NK来源于食源性微生物，无任何毒副作用，原料来源丰富，因而有很大的开发价值。

2 来源于其他微生物的溶栓药物

2.1来源于链霉菌的纤溶酶 链霉菌是多数抗生素生产的重要菌种，次级代谢产物丰富，可同时分泌多种蛋白酶，且为非致病菌，因此研究该种菌产生的活性物质具有重要的实际意义。

中国医学科学院筛选到产多种纤溶活性成分的链霉菌Y4051，并分离出了单亚基多肽链蛋白酶SW-1，可以直接降解纤维蛋白和纤维蛋白原，但不具有纤维蛋白特异性，可能造成系统性纤溶，因此在使用上受到一定限制。Chitte等2由链霉菌SD-5分离出来一种纤溶酶原激活剂，其相对分子量为35kD，最适pH值和温度分别为8和55°C，它的一大优点是在工业上有可能在较低的成本下进行大规模生产。鞠秀云等3从链霉菌XZNUM00004发酵液中纯化得到丝氨酸蛋白酶SFE1，其相对分子质量为20kDa，最适pH和最适温度分别为7.8和35℃。SFE1纤溶活性高且有耐热的优点，能够快速水解纤维蛋白原的三条链。Mander等4分别从三株链霉菌菌株CS624、CS684和CS628发酵液中分离得到三种纤溶酶FES624、FP84和FP28，其中FP28的相对分子质量为17.6kDa，是目前为止报道的链霉菌产生的最小的纤溶酶，可在两小时内分别水解纤维蛋白原的三条链，体外动物实验表明其具有很好的溶栓活性，在未来可发展成为有前景的溶栓药物。Uesugi等5从链霉菌中得到一种丝氨酸蛋白酶SOT，体外实验结果表明，SOT的纤溶活性是纤溶酶的18倍，同时也具有纤溶酶原激活剂活性。SOT能够迅速水解纤维蛋白原的A（-和B（-链，与纳豆激酶具有纤溶协同效应，可作为一种有效的溶栓剂用来进行血栓的治疗。

2.2海洋假单胞菌产生的溶栓活性物质 海洋微生物具有耐高压、噬低温、耐盐等生理特性，被认为是获取具有新型理化性质物质的又一重要来源。刘晨光等从海洋假单胞菌中提取得到一种分子量21kD的纤溶酶，最适pH值和最适温度分别为8和50℃，且该酶具有降解苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐的活性。对于该酶还需对其结构、催化特征以及毒理药效作用等作进一步研究，为进一步开发为新药和发酵工业生产提供科学依据。

2.3其他 天津科技大学分离出一株中国根霉 12#，刘晓兰等利用紫外线-氯化锂复合诱变的方式，得到酶产量较出发菌株提高32.9%的稳定高产正突变株，并通过固体发酵分离纯化得到分子量为18.0kD的纤溶酶，有直接降解纤维蛋白和纤溶酶原激活剂的的双重溶栓作用。Wodeuk等6从芽孢杆菌CK-114的发酵产物中分离纯化得到了枯草激酶CK，其分子量为28.2kD，最适pH值为7.0，且热稳定性较好，具有纤溶活性和促纤溶活性。目前CK已在许多动物模型中表现出较理想的体内溶栓效果。此外Lee等7还从密环菌发酵物中分离到具溶纤作用的金属蛋白酶，分子量为21kD，其最适pH值和温度分别为6和 33°C，能有效水解纤维蛋白原。

3 分子生物学研究

目前国内外正致力开发新一代溶栓剂，如用蛋白质工程手段分子改造，通过定点突变或改变相关结构域等手段提高对纤维蛋白的特异性、延长半衰期以及发展导向性溶栓功能等。

1992年Nadamura等8确定了纳豆激酶的基因序列和 氨基酸序列，为从基因工程角度提高纳豆激酶的产量和活性提供了可能。2003年彭勇等克隆了豆豉溶栓酶基因，又将α-淀粉酶启动子及信号肽与豆豉溶栓酶基因前肽及成熟肽序列融合，并将纯化标签His-Tag与豆豉溶栓酶基因融合，通过金属亲合柱进行纯化，简化纯化步骤，提高回收率。不同溶栓酶间存在很高的同源性，解析这些酶的空间结构并用生物信息学确定酶的功能氨基酸，可通过定点突变改造基因以提高酶比活和纤维蛋白特异性。利用 DNA 重排等定向进化手段来改造纤溶酶， 将可以提高纤溶酶产品的功效。

4 结论及展望

随着现代生物化学与分子生物学的发展，人们越来越关注微生物产生的溶栓活性物质，对产生大量蛋白酶的微生物进行筛选，并进行分离纯化、功能研究与开发，以及通过不同的分子生物学手段对蛋白酶结构及基因进行改造，重组表达出优化溶栓物质，降低副反应，获得工业化大规模生产，将成为这一领域今后的研究方向。

参考文献：

[1]王骏，王敏，王以光.链霉菌产生的新型纤溶酶的纯化和性质研究[J].生物工程学报，1999，15：147-153.

[2]Chitte R，Dey S.Potent fibrinolytic enzyme from a thermophilic Streptomyces megasporus strain SD5[J].Lett.Appl.Microbiol，2000，31：405-410.

[3]Ju X， Cao X， Sun Y， et al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme from Streptomyces sp. XZNUM00004[J]. World J Microb and Biot，2012，28：2479-2486

[4] SIMKHADA J R， MANDER P， CHO S S， et al. A novel fibrinolytic protease from Streptomyces sp. CS684[J]. Process Biochem，2010，45：88-93.

[5]Uesugi Y， Usuki H， Iwabuchi M， et al. Highly potent fibrinolytic serine protease from Streptomyces[J]. Enzyme Microb Tech，2011，48：7-12.

[6] Wodeuk K， Keehyun C. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp. strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang[J]. Appl Environ Microb， 1996， 62：2482-2488.

[7] Lee SY， Kim JS， Kim JE， et al. Purification and characterization of fibrinolytic enzyme from cultured mycelia of Armillaria mellea[J]. Protein Expres Purif， 2005，43：10- 17.

[8] Nadamura T，Youher Y，Eiji I. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene， apr N， of bacillus subtilis （natto）[J]. Biotech. Biochem，1992，56：1869.

编辑/王海静

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