植物耐盐基因筛选方法及其转基因育种研究

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zoޛ)j馟iC=N7um5]ӿ4i5^4ry材料在特定阶段所表达的基因,排除了基因组文库中内含子序列对筛选相关性状基因的影响,使筛选相关基因更加简单。例如cDNA-酵母表达文库,作为生产真核异源蛋白的宿主菌,酵母集分子遗传操作、原核微生物的生长性质、真核蛋白质的翻译后加工修饰等特点于一体,并且繁殖快,操作简单,是一种研究遗传学和分子生物学的有效工具,在挖掘耐盐资源的研究中得到广泛应用。杨晔[3]以筛选出的高耐盐旱柳无性系I-32为材料构建了旱柳全长cDNA文库。对随机挑取的阳性克隆进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定,插入片段平均长度为1 000 bp左右, 说明所构建的文库达到了用于目的基因分离筛选和表达的建库要求。通过尿嘧啶缺陷型培养基添加80~130 g/L氯化钠筛选文库,得到两个耐受130 g/L 的酵母转化子,插入片段分别为615 bp和1 152 bp,序列比对结果表明1 152 bp的cDNA与耐盐性有关。

1.2 基因组-文库

构建插入大片段基因组文库则可以更容易地分离到目的基因的全长DNA序列及调控元件。基因组文库主要是将大的基因组DNA片段与YAC或BAC连接转化酵母、细菌进行筛选。孟祥宗[4]以pCClBAC为载体,构建了盐藻(Dunaliella viridis)基因组细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共有9 216个转化子,插入片段平均长度为55 kb,约覆盖4倍盐藻基因组。同时还构建了该文库的四维PCR基因筛选体系,利用该体系可以通过4轮PCR快速筛选获得阳性单克隆,为克隆盐藻耐盐基因提供了更加便利的条件。Wang等[5]则构建了盐芥的细菌人工染色体文库(BIBAC),通过农杆菌侵染拟南芥筛选耐盐基因,对200个株系进行筛选,发现其中1个株系与野生型相比具有更高的耐盐性,说明该文库可能含有耐盐基因。

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