摘要：原生质体作为除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。通过实验充分掌握各种花瓣原生质体的分离方法并探究酶种类与浓度对原生质体分离的影响。早在1960年，Cocking用酶法制备高等植物原生质体首获成功【1】。1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生植株【2】。50多年来，已有近50科的植物原生质体培养获得了再生植株【3】。酶解法作为分离原生质体的一个常用技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，即可得到原生质体。
关键词：原生质体；酶解法
实验方法及过程
1 实验材料准备
将待处理的种子用自来水冲洗5min并用滤纸吸干，用75%酒精以及0.1%汞溶液消毒处理后接种在不含激素的1/2MS培养基上。【4】接种3d后种子萌发，待下胚轴长至2cm时，一部分剪碎用于原生质体游离材料，同时将另外部分子叶切成0.5cm×0.5cm小块，下胚轴切成0.5cm左右的小段接种于愈伤组织诱导培养基上，将初次诱导的愈伤组织（愈伤组织I）以及继代1次、继代2次的愈伤组织（愈伤组织Ⅱ、愈伤组织Ⅲ）用于原生质体游离。
2 酶解法得到原生质体
酶解过程一般在25℃左右下进行，通常采用混合酶液一步完成。植物材料与酶解液按一定比例混合。某些材料需要放在低速摇床上，以保证材料能够酶解充分。酶解时间从几小时到十几小时，依不同植物和不同外植体而定。但一般酶解时间不超过24小时。在酶解过程中要经常进行观察，当有大量的原生质体时，即可停止酶解进行纯化。在配制酶液时通常加入一些化学物质，以提高酶解效率或增强酶解原生质体的活力。酶液中加适量的CaCl2？2H20、KH2PO4等有利于提高细胞膜的稳定性和原生质体的活力，加入牛血清蛋白能够减少酶解过程中细胞器的损伤。
3 原生质体的纯化
经酶解处理后，得到的混合物是一个由原生质体、细胞团与细胞碎片等组成的混合液，首先对原生质体进行收集，原生质体混合液用滤网（40-100？m）去掉没有降解的细胞及组织，收集滤液。接着，对其进行洗涤，将网下物低速离心，去掉上清液，再加无酶液的CPW液悬起原生质体，再离心，弃上清，重复几次即可。 最后进行原生质体的纯化，采用上浮法进行纯化。将酶解的原生质体与23%的蔗糖溶液混合，用离心机离心5-10分钟，会在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。用吸管将带轻轻地吸出来，用培养基悬浮离心，然后稀释到104-105/ml，用于培养。
4 原生质体的培养
在实验过程中设计了四种不同的培养方法：
（1） 薄层漂浮培养：
纯化洗涤后的原生质体用少量（1～2 mL）KM8P液体培养基悬浮，再加入等量融化并预冷至40度的含0.4琼脂糖的KMSP培养基。混匀后倒入培养皿中，待凝固后加入2 mL液体培养基，使含原生质体的培养层漂浮在液体培养基表面。【5】
（2） 薄层漂浮看护培养：
与上述方法不同之处是在液体培养基中加入菊花花瓣愈伤组织的单细胞或小细胞团作看护细胞。
（3） 液体浅层培养：
纯化的原生质体悬浮在KMSP培养液中，薄层培养于培养皿中（2～3mL培养物/皿，直径60 mm）。
（4） 液体浅层一固体看护培养：
以含菊花花瓣愈伤组织细胞的固体培养基作看护层.在此培养基表面用液体浅层培养原生质体。
实验结论
不同植物用于分离原生质体的酶液浓度可能不一样，有的纤维素酶浓度高，有的果胶酶浓度高。大多数植物分离原生质体时，纤维素酶浓度在1%～3%，果胶酶在0.1%～1%。同一植物不同基因型或者不同外植体所用酶的种类和浓度也会不同。酶液最适pH范围一般在5.6～5.8，过高或过低均不适于原生质体分离。
实验总结
花卉，是美的象征。生活水平以及审美的提高，也使人们对花卉的要求越来越高，简简单单的杂交育种已经不能满足人们的要求。【6】通过酶解法将原生质体得以分离，运用物理化学等方法将原生质体纯化后进行培养，不同种原生质体进行融合从而使子代具有双亲的性质，进而使新种花卉无论从外在颜色还是样式都有不一样的视觉感受。另外，利用实验的方法找出最佳反应所需酶的组合以及最适酶浓度。原生质体的分离及融合为花卉业的发展奠定了基础。
参考文献：
[1]Cocking Ec.A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles[J].Nature （London），1960，187：962—963.
[2]TAKEBE I，LABIB G，MELCHERS G.Regeneration of whole plants from isolated mesophyll protoplasts of tobacco[J].Naturwissenschaften，1971，58：318—320.
[3]许智宏，卫志明.植物原生质体培养和遗传操作（第l版）.[M].上海：上海科技出版社.1997.
[4]王海波，玉永雄.紫花苜蓿原生质体游离条件的研究. 中国草地学报第28卷第5期. 2006年9月.33—37
[5]李名扬 陈薇.菊花花瓣愈伤组织原生质体培养再生植株. 农业生物技术学报第4卷第3期.1996年9月.243—248
[6]玉云韦、启翔、高亦珂. 转基因技术在观赏植物育种中的应用. 北京 林业大学学报. 第26 卷 第2 期.2004 年3 月.103—108
作者简介：
周旭（1995-），辽宁大连人.
裴嘉瑶（1995-），辽宁盘锦人.
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