江苏地区1株锦鲤疱疹病毒的鉴定

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摘要:对我国江苏地区养殖锦鲤暴发性鲤疱疹病毒病(koiherpes virus disease,简称KHVD)的病原进行鉴定。2018年5月,江苏省一锦鲤养殖场暴发不明原因传染疾病,病鱼肝、脾、肾脏中未分离到細菌。透射电镜观察发现大量球状病毒粒子。提取自然发病鱼的鳃、肾、脾、肝组织DNA作为模板进行PCR检测,结果显示为阳性。Blast比对结果显示,扩增序列与锦鲤疮疹病毒(koi herpesvirus,简称KHV)胸苷激酶(thymidine kinase,简称TK)基因和KHV DNA聚合酶(SPH)基因核苷酸序列同源性为99%。对病毒株的TK基因全长序列进行系统发育分析,证实该毒株属于KHV亚洲型毒株。

关键词:锦鲤;锦鲤疱疹病毒;病毒鉴定;系统进化分析

中图分类号:S941.41+2   文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2019)12-0200-04

鲤疱疹病毒病(koiherpes virus disease,简称KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,简称KHV)引起锦鲤和鲤鱼及其普通变种的一种急性、接触性传染病,该病被我国农业部列为二类动物疫病,对鲤鱼和锦鲤的养殖危害极大,致死率高达80%~100%[1~3]。其病原KHV是双链DNA病毒,基因组全长为295 kb[4],编码164个开放阅读框,KHV有多种基因型,目前已完成全基因组测序的分离株有日本株(KHV-J)、美国株(KHV-U)、以色列株(KHV-I)以及在我国分离的KHV-GZ11,其中,KHV-U、KHV-I和KHV-GZ11的相似性较高[4-5]。目前,我国国内报道并成功分离的KHV毒株有辽宁株(KHV-cj)、广州株(KHV-GZ1301)、黑龙江株(KHV-hlj)等[6-8]。现有研究表明,KHV是一种具有高传染性、高发病率和高死亡率的病毒性疾病,可感染任何年龄的锦鲤与鲤鱼,其典型临床症状是行动迟缓、食欲不振、体表尤其是皮肤和鳍基部出现出血症状,严重者眼球凹陷、鳃苍白并伴有中度至严重的坏死,感染后7~10 d开始出现死亡[9-11]。由于KHVD流行范围广,危害大,已经引起我国及世界多个国家的高度重视[12]。

2018年5月,江苏省苏州地区一锦鲤养殖场发生大面积死亡,发病鱼体表黏液明显增多,眼球凹陷,全身体表多处出血,尤其是鳍基部严重出血,剖检后可见病鱼脾脏、肾脏明显肿大,然而从内脏器官中未能分离检测到细菌,镜检也未见寄生虫。根据病鱼的临床特征及发病时间初步判断该病由KHV引起,为进一步验证导致锦鲤大量死亡的原因,根据我国水产行业标准SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法第1部分:锦鲤疱疹病毒》设计检测引物进行病毒PCR检测,对病灶部位的电镜观察显示。根据胸苷激酶(thymidine kinase,简称TK)基因全长序列建立系统发育树,研究其株型。本研究首次报道KHV在我国华东地区暴发流行。

1 材料与方法

1.1 病样的采集

患病鱼于2018年5月采自江苏省某观赏鱼养殖场,体长50 cm左右,充氧打包运输至实验室。

1.2 主要试剂

病毒DNA提取试剂盒、脑心浸液培养基(BHI)购自北京陆桥生物技术有限公司;PCR Mix预混液购自TaKaRa公司;戊二醛等试剂均为国产分析纯。

1.3 细菌学检查

对病鱼进行解剖观察,同时在无菌操作条件下,从肝脏、脾脏、肾脏取样进行BHI平板、血平板划线分离细菌,28 ℃培养24~48 h,观察病菌生长状况,待菌落形成后进行菌落纯化和鉴定。

1.4 电镜观察

以去离子水配制2.5%的戊二醛固定液,取鳃、肾、肝、脾组织切成薄片,浸泡于戊二醛固定液中固定,在用透射电镜观察前,将组织取出切成0.5 cm×0.5 cm大小的小块,用透射电子显微镜观察并拍照。

1.5 PCR鉴定

病鱼的组织DNA提取按照病毒DNA提取试剂盒的说明进行操作。PCR检测所用引物及检测方法参照我国水产行业标准SC/T 7212.1—2011《鲤疱疹病毒检测方法第1部分:锦鲤疱疹病毒》进行。引物由TaKaRa公司合成,引物序列见表1,TK基因的扩增体系为 50 μL,反应体系包括25 μL Mix预混液,2.5 μL DNA模板,引物各0.5 μL(浓度为 100 μmol/L),21.5 μL ddH2O,扩增条件:94 ℃预变性5 min;95 ℃变性1 min,51 ℃退火 1 min,72 ℃延伸1 min,40个循环;72 ℃ 10 min,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,预期得到约409 bp的PCR产物。SPH基因的扩增体系为100 μL,反应体系包括50 μL Mix预混液,5 μL DNA模板,引物各1 μL(浓度为 100 μmol/L),43 μL ddH2O,扩增条件:94 ℃ 预变性30 s;94 ℃变性30 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环;72 ℃ 10 min,用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,预期得到约292 bp的PCR产物。将PCR产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,将测得的序列登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行BLAST比对。

1.6 系统发育分析

2 结果与分析

2.1 解剖及病原检查

患病锦鲤体长约50 cm,鱼体明显缺乏活力,食欲减退,体表黏液增多,鳃丝发白(图1),病鱼鳍基部及体表出血严重(图2),解剖后发现脾脏等内脏肿大,其临床症状类似于KHV感染。制作鳃丝水浸片进行寄生虫的显微镜检查,未观察到寄生虫。

2.2 病原菌的分离

从病鱼的肝、脾、肾组织中未能分离到病原菌。

2.3 电镜观察

取病鱼的鳃、肾、脾、肝组织进行透射电镜观察,结果表明,在肾脏和脾脏组织中,可明显地观察到大量成熟或不成熟病毒粒子(圖3、图4),形状为圆形,有囊膜结构,其直径在200 nm左右,呈现出典型的疱疹病毒特征,由此证实该病毒对于鱼体的感染。

2.4 PCR鉴定

根据我国水产行业标准(SC/T 7212.1—2011)提供的PCR检测方法对发病鱼的鳃、肾、肝、脾进行KHV的TK和SPH基因特异性PCR扩增,均检测到预期大小的片段(图5),对PCR产物进行测序,经NCBI比对,序列与KHV的TK和SPH基因序列具有99%的同源性,将该毒株命名为KHV-JS。

2.5 系统发育分析

对KHV-JS样进行TK全长序列扩增,将1 000 bp左右的目的片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行克隆测序。结果显示,分离株的TK基因全长为997 bp,将测得序列与GenBank中登录的KHV序列进行比较,其与KHV-A1的同源性为100%。依据邻接法利用MEGA 7.0建立系统发育树,从图6可以看出,本试验中鉴定的KHV-JS株与各个亚洲株型聚在了一起,为典型KHV亚洲株型。

3 讨论

锦鲤疱疹病毒病是一种具有高传染性、高发病率和高死亡率的病毒性疾病,给我国及世界多个国家的锦鲤及鲤鱼养殖业造成严重的经济损失,被世界动物卫生组织水生动物疫病名录收录[15]。KHVD一般发病于春秋季节,高温夏季、低温冬季不发病,发病温度为18~28 ℃[16],主要感染各个生长阶段的锦鲤和鲤鱼,相关研究表明,金鱼[12]、异育银鲫[17]等鱼类也有可能感染KHV,并可能作为病毒携带者,但是到目前为止还没有除锦鲤和鲤鱼以外的其他鱼类感染KHV导致发病的报道。鲤鱼是我国的主要淡水养殖鱼类之一,锦鲤则是我国最主要的观赏鱼养殖品种之一,一旦暴发锦鲤疱疹病毒病,高达100%的死亡率将给我国水产养殖和观赏鱼产业带来巨大的经济损失,因此,亟须开展对该病的流行病学调查和防控研究。

目前,我国已有多地流行和暴发过KHVD,主要集中在广东、东北和四川等地区,国内报道并成功分离的KHV毒株有广州株(KHV-GZ11和KHV-GZ1301)、辽宁株(KHV-cj)、黑龙江株(KHV-hlj),其中,除广州株KHV-GZ11属于欧洲株型外,其他毒株均属于亚洲株型。本研究首次报道KHVD在我国华东地区的暴发,并且成功分离鉴定了KHV-JS株。江苏省是我国淡水鱼养殖大省,全省水产养殖面积达到

63.21 hm2,其中淡水养殖总面积为43.98 hm2,水产品总产量达328.1万t,主要养殖青鱼(Mylopharyngodon piceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、鲫鱼(Carassius auratus)等,观赏鱼养殖规模达到86 234万尾,占全国总规模的20.73%,锦鲤作为一种重要的观赏鱼类,深受消费者喜爱,具有广阔的市场前景,然而鲤疱疹病毒病的高死亡率以及具有潜伏感染的特性[18],严重威胁着锦鲤和鲤鱼养殖业的安全。

疫苗是控制病毒性疾病最有效的途径,在一些常见的水产动物病毒病上应用广泛。减毒疫苗以及改良的活疫苗都被证明具有显著的抗病效果,但是其潜在的安全隐患仍然令人担忧,一系列不安全因素阻碍了其在生产上的应用[19]。相比传统疫苗,DNA疫苗更安全,没有毒力返强的风险,是病毒疫苗未来的发展趋势,由于不同地区KHV毒株基因型具有一定的差异性,因此对不同来源毒株进行系统发育分析以及株型鉴定,对于DNA疫苗的研制具有重要意义。Kurita等证明,来自亚洲和欧洲的隔离群有着明显的基因差异,可通过对TK基因全长序列的测定将KHV毒株区分为欧洲型和亚洲型[13]。本研究获得KHV-JS的TK基因全长序列为997 bp,经MEGA 7.0构建系统发育树,表明KHV-JS属于亚洲株型。本研究首次从我国华东地区分离鉴定1株KHV,可为KHV起源进化、分类以及疾病诊断和防控提供重要依据。

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