鼠源性HSP70、GM—CSF双修饰前列腺癌全细胞疫苗的建立与鉴定

材料与方法

1.1 主要试剂与材料

鼠前列腺癌细胞系RM-1细胞株购自于中科院上海细胞库，293T由本实验室保存；pMD18-T 载体购自Takara公司；限制性内切酶BamHI和AscI，T4 DNA连接酶购自NEB公司；感受态细胞DH5α购自北京全式金公司；platinum Pfx DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、慢病毒载体pLenti6.3-MCS、包装质粒混合物ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清、转染试剂lipofectamine 2000、Opti-MEM 培养液、胰蛋白酶0.25% Trypsin-EDTA均购自life technologies公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂PMSF、标签抗体兔抗鼠Myc均购自cell signaling 公司；标签抗体兔抗鼠V5购自Abcam 公司；HRP标记羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司；BCA蛋白测量试剂盒Thermo scientific公司；增强型化学发光检测试剂盒购自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 TA克隆 根据Genbank中 Hspa1a（NM-010479.2）和Csf2（NM-009969.4）的基因信息，对所需合成的目的序列进行分析，检查基因内部有无特别复杂二级结构和重复序列连接。根据基因序列分析的结果，分别进行单链oligo的设计及化学合成。利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因序列（其中目的序列Hspa1a末端插入标签蛋白cMyc基因序列，Csf2末端插入标签蛋白V5基因序列）。将合成好的序列装入pMD18-T载体并转化至感受态细胞DH5a。测序验证重组克隆中插入序列是否与要求相一致。本部分内容由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2.2 亚克隆 BamHI/AscI双酶切TA克隆的目的片段，37℃酶切2 h，酶切体系为：10×buffer 5 μL，目的片段10 μL（约1 μg），BamHI 1μL，AscI 1 μL，ddH2O 23 μL。用BamHI/AscI把pLenti6.3_MCS进行酶切，37℃酶切2 h，酶切体系为：10×buffer 5 μL，pLenti6.3_MCS 2 μL（约1 μg），BamHI 1 μL，AscI 1 μL，ddH2O 41 μL。电泳，回收酶切的目的片段。T4 DNA连接酶连接回收的片段与载体，室温连接2 h，连接体系如下：连接缓冲液1 μL，慢病毒载体1 μL，目的片段2 μL，T4 DNA连接酶0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。取5 μL连接产物转化感受态细胞DH5a。从转化的平板上挑去多个阳性单克隆进行测序验证。

1.2.3 慢病毒的包装与病毒滴度测定 取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10 cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5% CO2 的培养箱中培养过夜。第2天转染前移去培养液，添加5 mL Opti-MEM培养液，取9 μg ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix和3 μg慢病毒表达质粒加入1.5 mL Opti-MEM（经37℃预热）中轻轻混匀，取36 μL lipofectamine2000 加入1.5 mL Opti-MEM中轻轻混匀，室温放置5 min；轻轻混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20 min。将3 mL质粒脂质体复合物小心地加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃，5% CO2的培养箱中孵育6 h后，更换完全培养液DMEM+10%FBS。48 h后收集细胞培养上清，3000 rpm 离心10 min，去除细胞和碎片，并用0.45 μm的滤器过滤。将病毒原液在50000 g下超速离心2 h，去除上清，重悬于DMEM培养液中，置于-80℃ 保存备用，并留少量慢病毒测定物理滴度。利用逐孔稀释滴度测定法和荧光定量PCR法测定病毒滴度。标准品原液和病毒原液各10 μL分别进行1∶10梯度稀释，如取10 μL的慢病毒原液用无菌水稀释100 μL，作为Lv-1，取10 μL Lv-1，用无菌水稀释至100 μL，设为Lv-2，取10 μL Lv-2，用无菌水稀释至100 μL，设为Lv-3，共计6个浓度。将标准品和各稀释度的慢病毒样品，通过实时荧光定量PCR检测，并计算各稀释液中的病毒滴度，如果三个稀释度的CT值均在标准曲线范围内，可取其平均值。

1.2.4 慢病毒感染RM-1细胞 取对数生长的RM-1细胞，以2×105/孔接种于6孔板中，37℃，5% CO2的培养箱中培养，待细胞融合度达到30%～50%时，加入慢病毒感染液进行实验。实验分成5组，分别为CON组（空白对照组）、NC组（空病毒载体感染组）、pLenti6.3_ MCS_Hspa1a_cMyc病毒载体感染组、pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5病毒载体感染组、pLenti6.3_MCS_Hspa1a_ cMyc/pLenti6.3_MCS_CSf2_V5病毒载体共感染组。预实验明确pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc病毒载体感染组感染细胞的最佳感染复数（multiplicity of infection， MOI）值为8，pLenti6.3_MCS_CSf2_V5病毒载体感染组最佳MOI值为10。根据预实验最佳MOI值，在RM-1细胞中加入适量病毒，12 h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24 h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基。

1.2.5 筛选稳定表达 HSP70、GM-CSF、HSP70/GM-CSF的RM-1细胞株并经γ射线灭活后冻存慢病毒感染RM-1细胞48 h后，加入稻瘟菌素（Blasticidin，BSD） 4 μg/mL的选择性培养基进行筛选，10～14 d后可见阳性克隆生长，挑去单细胞克隆，在24孔板中继续扩大培养，大约4周左右可获得稳定转染的克隆细胞。收集病毒稳定感染的RM-1细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量检测蛋白浓度。每个样品取50 μg，10% SDS-PAGE凝胶电泳，经转膜、封闭后一抗4℃过夜。兔抗鼠cMyc和V5一抗孵育后加入HRP标记的二抗，ECL发光，最后进行胶片曝光、显影定影。10 GYγ射线照射稳定感染慢病毒的RM-1细胞后，-80℃保存待用。

2 结果

2.1 慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的片段Hspa1a与CSf2 的PCR产物经纯化后分别与载体酶切、连接、转化，挑取阳性菌落克隆进行菌液PCR鉴定测序后，用SECentral软件与鼠Hspa1a（GenBank：NM-010479.2）、CSf2 cDNA（GenBank：NM_ 009969.4）序列比对，载体插入序列与Hspa1a、CSf2 cDNA序列一致（封三图1A为Hspa1a部分测序序列，封三图1B为CSf2部分测序序列），表明重组载体pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_CSf2_V5构建成功。

2.2 慢病毒包装与病毒滴度测定

将构建成功的质粒与包装质粒混合物共转染293T细胞，采用利用逐孔稀释滴度测定法和荧光定量PCR法测定病毒滴度。慢病毒pLenti6.3_MCS_ Hspa1a_cMyc浓缩后的病毒滴度测定计算结果为（5.04×108）TU/mL，慢病毒pLenti6.3_MCS_CSf2_V5浓缩后的病毒滴度为（6×108）TU/mL。

2.3 慢病毒感染RM-1后Western blot检测HSP70、GM-CSF蛋白的表达

慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc感染RM-1后提蛋白，以cMyc为抗原检测融合蛋白Hspa1a_cMyc的表达，结果观察到70～100 kDa之间有一条特异性条带，其大小和Hspa1a_cMyc融合蛋白相符合（HSP70蛋白分量为70 kDa，cMyc标签对目的蛋白分子量影响较小）（图2A，第4泳道）；慢病毒pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5感染RM-1，以V5为抗原检测融合蛋白CSf2_ V5的表达，结果观察到25 kDa左右有一条特异性条带，其大小和CSf2_V5融合蛋白相符合（鼠CSf2蛋白分子量为22 kDa）（图2B，第3泳道）。慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc与pLenti6.3_MCS_CSf2-V5共感染RM-1，以cMyc为抗原检测时，结果观察到70～100 kDa之间有一条特异性条带，以V5为抗原检测时结果观察到25 kDa左右有一条特异性条带（图2A，第5泳道；图2B，第5泳道）。这些结果说明包装产生的高滴度慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc、pLenti6.3_MCS_CSf2_V5感染细胞后能稳定表达Hsp70和GM-CSF蛋白。

A：以cMyc为抗原检测融合蛋白Hspa1a_cMyc的表达；B：以cMyc为抗原检测融合蛋白Csf2_V5的表达。

1：空白对照；2：空载体对照；3：转染慢病毒pLenti6.3_MCS_CSf2_V5组；4：转染慢病毒pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc组；5：共转染pLenti6.3_ MCS_CSf2_V5/pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc组

图2 Western blot 检测病毒稳定感染RM-1后细胞中融合蛋白Hspa1a_cMyc、CSf2_V5、Hspa1a_cMyc/CSf2_V5的表达

3 讨论

目前免疫治疗已经成为前列腺癌治疗中的热点。多种疫苗、细胞因子和抗体已应用于前列腺癌的治疗，并表现出了一定效果。目前已经进入临床试验和正在进一步发展的前列腺癌免疫治疗的方法和专利包括树突状疫苗（如APC8015[2]，DCVax-Prostate[3]）、全细胞疫苗（如GVAX[4]）、DNA疫苗（Prostvac-VF[5]）、单克隆抗体（如MDX-010[6]，MK-3475[7]，J591[8]）等。

在诸多的免疫治疗手段中，研究较多的是APC8015和GVAX。APC8015（sipuleucel-T，Provenge）是一种治疗CRPC的树突状细胞疫苗，由于树突状细胞是一种最有效的抗原递呈细胞，使树突状细胞疫苗成为前列腺癌免疫治疗中的首选方式之一。研究者们在2010年6月报道了一项多中心的，随机、对照、双盲的临床研究结果，在这项重要的研究里，与对照组比较，APC8015（又称sipuleucel-T）降低了22%的激素抵抗性前列腺癌的死亡危险，36个月的生存概率sipuleucel-T较对照组高8.7%[2]。由于这个重要的结果，FDA批准sipuleucel-T在临床上的使用[9]，sipuleucel-T是首个供临床应用的前列腺癌治疗性疫苗，也是近年来前列腺癌诊治研究上最重要的进展[10-11]。

与sipuleucel-T同一阶段进入Ⅲ期临床试验的还有全肿瘤细胞疫苗GVAX。GVAX即使用前列腺癌细胞系Lncap和PC3，经过基因修饰后，使其表达巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF）。GM-CSF是一种最强的树突状细胞活化因子，因而有利于树突状细胞在体内的局部聚集和活化，增强对前列腺癌抗原的识别和递呈。在Ⅰ期和Ⅱ期临床试验中，GVAX能够降低血PSA水平，延缓PSA再上升时间[12]。然而GVAX在Ⅲ期临床试验中却令人失望。至2009年，相继两项大规模关于GVAX的Ⅲ期临床试验因效果不佳而被迫提前终止[13-14]。

与基于自体树突状细胞的肿瘤疫苗比较，基于肿瘤细胞株的全细胞疫苗有一定优点。一方面，全细胞疫苗理论上含有肿瘤相关抗原（tumor associated antigens，TAAs），另一方面，无需针对每个患者进行单独的个体疫苗制备，因而更适合规模制备和质量控制。然而，全细胞疫苗同样存在明显的缺点，那就是免疫原性不高，虽然经过基因改造增加局部GM-CSF表达，促进体内树突状细胞聚集、增殖和抗原递呈功能，与树突状细胞疫苗比较，全细胞疫苗上仍然存在免疫原性差的问题。

在免疫识别过程中，HSP对抗原递呈特别重要。特别是Hsp70，它能够结合TAAs，将TTAs传递到APC表面与主要组织相容复合物（major histocompatibility complex， MHC-1）类分子结合，此后APC细胞通过相互递呈机制，将肿瘤抗原识别信号递呈给T细胞，激活细胞免疫。由于HSP70能够结合多种TAAs，促进树突状细胞等APCs的识别和吞噬，并且提供免疫激活的关键信号[15]，以HSP70为基础的治疗性疫苗表现出一定提升肿瘤免疫的效果[16-17]。我们认为，HSP70的这个特性特别适合用于全细胞抗原的免疫增强。此外，树突状细胞含有热休克蛋白受体，易于被树突状细胞识别捕获，并进行处理和抗原递呈，我们认为，HSP70的这个特性与GM-CSF的激活DCs的特性恰恰互补，一个激活抗原递呈细胞，一个强化抗原递呈过程。基于HSP70与GM-CSF在抗原识别与递呈方面良好的协同作用机制，HSP70，GM-CSF双修饰的激素非依赖性前列腺癌全细胞疫苗可能具有良好的治疗效果。

慢病毒载体是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统，具有转移效率高、其介导的基因表达持续稳定、随宿主细胞基因组分裂而分裂及适用范围广等优点，已越来越受研究人员的青睐。本研究使用慢病毒载体载入鼠源性GM-CSF分子、sHSP70分子感染293T细胞后经测序验证，成功构建慢病毒表达载体pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5；通过病毒包装、收集和浓缩，得到了高滴度慢病毒颗粒；用于稳定感染细胞后，Western blot 检测到GM-CSF和HSP70的蛋白表达，成功获得了鼠源性HSP70、GM-CSF双修饰鼠前列腺癌全细胞疫苗。

综上所述，本实验成功建立了鼠RM-1细胞系全细胞疫苗，为日后发展进一步研究全细胞抗原作用机制，并为发展新型人源性前列腺癌疫苗建立基础。

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（收稿日期：2015-02-10）

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